曹紅剛，范家恒，李亮梅，趙風云

（昆明理工大學食品工程研究中心，云南昆明650500）

草菇（Volvariella volvacea）又名稻草菇，國際上稱之為“中國蘑菇”，在熱帶和亞熱帶地區(qū)被廣泛栽培[1]。草菇子實體味道鮮美，營養(yǎng)豐富，深受消費者的喜愛[2-3]。草菇在菌種保藏和栽培過程中，通常使用化學藥物，如抗生素、甲醛、多菌靈等化學藥物控制其他微生物的污染[4]，這些化學藥物在抑制雜菌的同時，不免進入草菇子實體中，從而影響草菇的食用安全。蜂膠作為一種天然、無毒的廣譜抗菌劑，若將其代替化學藥物抑制草菇在菌種保藏和生產(chǎn)過程中的污染，可在一定程度上增強草菇的食用安全性。

蜂膠是西方蜜蜂（Apismellifera）采集植物樹脂，并混入蜂蠟、花粉及蜜蜂腺體分泌物后經(jīng)蜜蜂咀嚼加工而成的一種粘稠物質(zhì)[5]。蜜蜂利用蜂膠填補蜂巢空隙，光滑蜂巢內(nèi)壁，并利用蜂膠防止巢房內(nèi)異物的腐爛和病菌的傳染等[6]。黃酮類化合物是蜂膠中的重要生物學活性物質(zhì)[5]。研究發(fā)現(xiàn)蜂膠的抑菌活性[7]、殺蟲性[8]、抗氧化活性[9]等藥理學活性與其中的黃酮類化合物有密切關系，因此黃酮類化合物的含量常作為蜂膠質(zhì)量控制的一個重要的指標[10]。

Sawaya等發(fā)現(xiàn)不同提取方法和提取溶劑獲得的蜂膠，其化學成分存在差異，其抑菌活性各自不同[11]。由于黃酮類化合物多為脂溶性，本實驗采用75%的乙醇、95%的乙醇、75%的乙酸乙酯、95%的乙酸乙酯提取蜂膠中的活性成分，并對草菇及其污染菌進行抑制作用研究。以期得出蜂膠的提取方法、提取液濃度等因素對草菇及污染菌的抑制作用影響。作為一種天然抑菌劑，蜂膠已被用于果蔬、肉制品、乳品、雞蛋等食品的防腐保鮮[12-14]，然而，可否添加于草菇菌種和栽培生產(chǎn)中，延長菌種保藏，抑制雜菌污染，尚未見報道，本研究可為蜂膠的廣泛應用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草菇V23 本實驗室保藏菌種；粗蜂膠 采自云南蒙自；馬鈴薯綜合培養(yǎng)基（potato dextrose agar medium，PDA） 馬鈴薯20%，葡萄糖2%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂0.15%，瓊脂2%，pH自然；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（beef-protein agar medium，BPA） 牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化鈉1.5%，瓊脂2%，pH自然。

AL204電子分析天平 中國梅特勒-托利多（上海）有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度計日本島津公司；ES-315高壓滅菌鍋日本TOMY KOGYO公司；KQ-500DB超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 蜂膠提取工藝

1.2.1 蜂膠的提取 稱取適量粗蜂膠，置于-20℃下24h后，取出磨碎，稱取磨碎后的蜂膠10g，分別用40m L 75%的乙醇、95%的乙醇、75%的乙酸乙酯、95%的乙酸乙酯，在40℃下浸48h，離心取上清液，-2℃下保存待用。濾渣洗滌、干燥并稱重，計算可溶物含量和蜂膠提取液濃度。

蜂膠提取液濃度（mg/m L）=蜂膠總量（mg）×可溶物含量（%）/液總體積（m L）×100

1.2.2 黃酮含量的測定 蜂膠總黃酮含量的測定[15]：取蜂膠提取液1m L，加入1m L 5%NaNO3溶液，1m L 10%A l（NO3）3溶液，10m L 4.3%NaOH溶液，定容至25m L，搖勻，靜置15m in，于517nm下測吸光值。以蘆丁為標品做標準曲線。

1.3 草菇菌種污染菌的分離與初步鑒定

1.3.1 細菌 取草菇污染菌種接種于BPA平板，37℃培養(yǎng)24h，用接種環(huán)挑去少許細菌劃線分離，培養(yǎng)出單菌落，通過菌落大小、形態(tài)、色澤及染色、鏡檢進行菌種鑒定。

1.3.2 霉菌 取草菇污染菌種接種于PDA平板，28℃培養(yǎng)1～2d，因污染菌生長速度大于草菇，從霉菌菌絲末端切取新生菌絲接種于新PDA平板上，培養(yǎng)1～2d，通過菌落大小、形態(tài)、表面特征、菌絲色澤及染色、鏡檢進行菌種鑒定。

1.4 蜂膠提取液對草菇、霉菌及細菌的抑制作用

將4種蜂膠提取液用蒸餾水分別稀釋20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、400倍，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，收集濾液進行抑制實驗，實驗方法為：

1.4.1 草菇、霉菌 吸取1m L蜂膠稀釋液用無菌L棒涂布于PDA平板，接種活化后的草菇或青霉菌，28℃恒溫培養(yǎng)，對照組為相應的含有相同量的乙酸乙酯水或乙醇水，72h后測定菌落直徑，每組實驗設三個平行，計算抑制率。

1.4.2 細菌 制備濃度為1×106CFU的細菌菌懸液，涂布于BPA平板上，37℃恒溫培養(yǎng)，待其長滿培養(yǎng)基后，取直徑約為6mm的菌塊，接種至涂布有蜂膠稀釋液的BPA平板上，對照組為相應的含有相同量的乙酸乙酯水或乙醇水，48h后測定抑菌圈直徑，每組實驗設三個平行，計算抑制率。

抑制率（%）=[對照組菌落直徑（mm）-實驗組菌落直徑（mm）]/對照組菌落直徑（mm）×100

2 結果與分析

2.1 不同濃度乙醇和乙酸乙酯對蜂膠可溶物和黃酮含量的影響

本實驗采用75%乙醇、95%乙醇、75%乙酸乙酯、95%乙酸乙酯浸提粗蜂膠，測定其可溶物含量、黃酮含量。以蘆丁作為標品，繪制標準曲線得出回歸方程為y=10.95x-0.0042，R2=0.9997，依據(jù)此方程可求出黃酮含量。結果如表1所示，95%乙酸乙酯提取的蜂膠可溶物含量為60.3%，黃酮含量為6.23mg/m L，均顯著高于其他3個溶劑（p＜0.05），而75%和95%的乙醇提取液的可溶物含量和黃酮含量之間的差異不顯著（p＞0.05）。

黃酮類化合物是蜂膠中重要的活性成分，其種類繁多，結構與性質(zhì)不同，在不同溶劑中的溶解性也不同。Vardar-Unlu G等認為提取溶劑的選擇蜂膠提取物的成分有重要影響[16]。本實驗中相同濃度的乙酸乙酯與乙醇，乙酸乙酯的提取效果優(yōu)于乙醇提取效果，根據(jù)相似相溶原理，可初步推斷云南蒙自蜂膠中含有較多極性較弱的黃酮類化合物。

表1 乙醇與乙酸乙酯的蜂膠提取成分對比Table1 Comparison of propolis extractby ethanol and ethyl acetate

本實驗中提取的蜂膠液中黃酮含量為4.92～6.23mg/m L。胡福良等[17]、唐坤等[18]提取市售商品蜂膠中黃酮，其含量分別為51.4mg/m L和41.61mg/g，顯著高于本實驗的黃酮含量。其原因可能是：本實驗采用的原料是采自云南蒙自蜂場的未加工的粗蜂膠，含有較多的蜂蠟等雜質(zhì)，可溶物含量僅為48.1%～60.3%，使得提取液中的黃酮類化合物的含量偏低；蜂膠提取液中的黃酮類化合物的種類、含量與蜂膠來源、提取試劑、測定方法等因素有關，也會造成不同實驗的測定數(shù)據(jù)有一定的差異性。

2.2 草菇污染菌的初步鑒定結果

2.2.1 細菌的形態(tài)特征 37℃培養(yǎng)24h，菌落直徑為1～5mm，乳白色，不透明，邊緣不規(guī)則，表面干燥粗糙、無隆起；經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，菌體呈陽性，短桿狀。

對該細菌的菌落特征和顯微特征初步鑒定為革蘭氏陽性桿菌。

2.2.2 霉菌形態(tài)特征 28℃培養(yǎng)2d，菌落直徑為0.5～ 1cm，剛長出菌落為淡黃色，隨菌落生長，中心出現(xiàn)墨綠色并向上突起，擴展過程中菌落邊緣有一圈白色菌絲；正反顏色不同，背面為淺黃色；菌落生長致密、不透明、干燥；隨菌落生長，白色菌絲消失，最終為墨綠色。

對菌株進行染色、制片，顯微鏡檢特征為菌絲無色，分生孢子梗單枝，較長，無足細胞，有橫膈膜；孢子梗頂端不膨大，排列成帚狀的間枝，分支1次或2次，對稱，頂層為小梗，上生分生孢子串，分生孢子串呈不分枝的鏈狀；帚狀枝較短，排列緊密。單個分生孢子為球形或橢圓形，紫紅色。

對該霉菌的菌落特征和顯微特征初步鑒定為叢梗孢科（Moniliaceae），青霉屬（Penicillium）。

2.3 蜂膠提取液對草菇及其污染菌的抑菌作用

將4種蜂膠提取液用蒸餾水進行梯度稀釋，得到稀釋液的蜂膠提取液濃度如表2所示。

表2 4種蜂膠在不同稀釋度下的蜂膠提取液濃度（mg/mL）Table2 The concentration of 4 kinds of propolis extraction in different dilutions（mg/mL）

圖1 75%乙醇提取液對草菇、霉菌、細菌的抑制曲線Fig.1 Inhibition curve of propolis extract by 75%ethanol on V.volvacea，bacteria andmould

由圖1～圖4可知，蜂膠提取液對草菇、霉菌和細菌的抑制作用趨勢相似，隨著稀釋倍數(shù)的增加，蜂膠提取液對草菇、霉菌、細菌的抑制作用逐漸減弱；相同濃度的蜂膠液對草菇、霉菌及細菌的抑制作用強弱順序為細菌＞草菇＞霉菌。進一步比較4種蜂膠提取液的抑菌作用發(fā)現(xiàn)，95%乙酸乙酯蜂膠提取液抑菌效果較優(yōu)。由圖4可知，蜂膠液在60倍（2.5mg/m L）的稀釋度下，對細菌的抑制率為100%（致死）；在20倍（7.5mg/m L）的稀釋度下，對草菇是致死的；蜂膠提取液原液對霉菌的抑制率為72.83%，高于其他3種提取液的抑制效果（p＞0.05）。

圖2 95%乙醇提取液對草菇、霉菌、細菌的抑制曲線Fig.2 Inhibition curve of propolis extract by 95%ethanol on V.volvacea，bacteria andmould

圖3 75%乙酸乙酯提取液對草菇、霉菌、細菌的抑制曲線Fig.3 Inhibition curve of propolis extractby 75%ethyl acetate on V.volvacea，bacteria and mould

圖4 95%乙酸乙酯提取液對草菇、霉菌、細菌的抑制曲線Fig.4 Inhibition curve of propolis extractby 95%ethyl acetate on V.volvacea，bacteria and mould

抑菌實驗表明，相同濃度的蜂膠浸提液對草菇及污染菌的抑制作用不同，其抑制作用強弱順序為細菌＞草菇＞霉菌，因此在草菇的栽培過程中，添加適量的蜂膠提取液可有效抑制細菌的污染，但對控制霉菌的污染效果不夠顯著。這與楊艷彬等[19]的研究結果一致，蜂膠提取液對細菌的抑制作用更明顯。

2.4 黃酮含量與抑菌作用的相關性分析

對蜂膠提取液中的黃酮含量和草菇及污染菌的抑菌作用進行相關性分析。由表3可知，草菇、霉菌和細菌的抑制率與黃酮含量的相關系數(shù)均大于0.9，說明黃酮含量和抑菌效果有較強的相關性，黃酮含量越高，抑菌效果越強；與Pepeljnjak等得出的蜂膠抗菌效果和蜂膠中黃酮類物質(zhì)含量成正比的結論一致[20]。也進一步驗證了黃酮類物質(zhì)是一種重要的抗菌活性成分。

表3 蜂膠提取液中黃酮含量與抑菌作用的相關性分析Table3 Correlations analysis between antimicrobial effectand flavonoid content

3 結論

本研究以云南蒙自的粗蜂膠為材料，采用75%乙醇、95%乙醇、75%乙酸乙酯、95%乙酸乙酯浸提，測定蜂膠提取液的黃酮含量，并進行草菇及分離獲得的污染菌的抑制作用研究。結果表明：分離獲得的草菇污染菌初步鑒定為革蘭氏陽性細菌和青霉屬菌。95%乙酸乙酯提取效果優(yōu)于其他三種溶劑（p＜0.05），4種蜂膠提取液對草菇及污染菌均有一定的抑制作用，抑制強弱為細菌＞草菇＞霉菌。相關性分析表明，草菇、霉菌和細菌的抑制率與黃酮含量的相關系數(shù)均大于0.9，有較強的相關性。本研究表明，蜂膠提取液可以有效抑制草菇的生長速度，添加適量蜂膠液能適當延緩草菇菌種的退化速度。同時，將適量的蜂膠提取液代替合成的抗生素、殺菌劑等，應用于草菇的栽培生產(chǎn)、子實體保鮮及菌種保藏中，可有效抑制細菌污染，有一定的應用意義。

[1]Chang S T.Biology and cultivation technology of Volvariella volvacea[M].Hong Kong：The Chinese University Press，1993：73-83.

[2]Hsu H C，Hsu C I，Lin R H，et al.Fip-vvo，a new fungal immunomodulatory protein isolated from Volvariella volvacea[J].Biochemical Journal，1997，323（Part2）：557-565.

[3]She Q B，Ng T B，Liu W K.A novel lectin with potent immunomodulatory activity isolated from both fruiting bodies and cultured mycelia of the ediblemushroom Volvariella volvace a[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，1998，247（1）：106-111.

[4]陳貴省.草菇雜菌污染的綜合防治[J].植保技術與推廣，2003，23（1）：16-17.

[5]Bankova V S，de Castro SL，MarcucciM C.Propolis：recent advances in chemistry and plant origin[J].Apidologie，2000，31（1）：3-15.

[6]Kismet K，Kilicoglu B，Koru O，et al.Evaluation on scolicidal efficacy of propolis[J].European Surgical Research，2006，38（5）：476-481.

[7]Popova M，Silici S，Kaftanoglu O，et al.Antibacterial activity of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical composition[J].Phytomedicine，2005，12（3）：221-228.

[8]Prytzyk E，Dantas A P，Salomao K，et al.Flavonoids and trypanocidal activity of Bulgarian propolis[J].Journal of Ethnopharmacology，2003，88（2-3）：189-193.

[9]Lima B，Tapia A，Luna L，et al.Main flavonoids，DPPH activity，andmetal contentallow determination of the geographical origin of propolis from the province of san juan（Argentina）[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（7）：2691-2698.

[10]Sha N，Guan S H，Lu Z Q，et al.Cytotoxic constituents of chinese propolis[J].Journal of Natural Products，2009，72（4）：799-801.

[11]Sawaya A，Souza K S，Marcucci M C，et al.Analysis of the composition of Brazilian propolis extracts by chromatography and evaluation of their in vitro activity against Gram-positive bacteria[J].Brazilian Journal of Microbiology，2004，35（1-2）：104-109.

[12]倪輝，楊遠帆.蜂膠對雞蛋保鮮作用的研究[J].食品工業(yè)科技，2001，22（4）：12-14.

[13]魏強華，張娜萍，陳業(yè)，等.蜂膠涂膜劑在番茄保鮮中的應用[J].食品工業(yè)科技，2009，30（2）：278-280.

[14]盧兆蕓.蜂膠保鮮機理及其在食品保鮮中的應用[J].食品工業(yè)科技，2008，29（9）：305-308.

[15]余晶晶，董群義.超聲波協(xié)同萃取蜂膠中黃酮類物質(zhì)的研究[J].食品工業(yè)科技，2013，34（4）：314-317.

[16]Vardar-Unlu G，Silici S，Unlu M.Composition and in vitro antimicrobial activity of Populus buds and poplar-type propolis [J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，24（7）：1011-1017.

[17]胡福良，李英華，朱威，等.不同方法提取的蜂膠液中總黃酮含量的測定及抗腫瘤與抗炎作用研究[J].中國食品學報，2005，5（3）：11-15.

[18]唐坤，李標，蔡應繁，等.微波-超聲波提取蜂膠的工藝研究[J].食品研究與開發(fā)，2008，29（10）：74-77.

[19]楊艷彬，翟勝江，李登華，等.蜂膠抑菌防腐作用的研究及在王漿蜜生產(chǎn)中的應用[J].食品工業(yè)科技，1999，20（1）：23-24.

[20]Pepeljnjak S，Kosalec I.Galangin expresses bactericidal activity againstmultiple-resistant bacteria：MRSA，Enterococcus spp.and Pseudomonas aeruginosa[J].Fems Microbiology Letters，2004，240（1）：111-116.