牟英杰，林海君，楊麗杰，李丹鳳，霍貴成

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150030）

谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（TG，蛋白質(zhì)-谷氨酰胺γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶，EC 2.3.2.13），又名轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，是一種?；D(zhuǎn)移酶，能催化蛋白質(zhì)及多肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-酰胺基（?；w）和伯胺（?；荏w）之間的酰胺基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，在蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間交聯(lián)，形成ε-（γ-谷氨酰胺）賴氨酸異肽鍵[1-2]，改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，如乳化性、流變性、溶解性等。此外，還能引入賴氨酸提高食品的營養(yǎng)價(jià)值。

經(jīng)過熱處理的乳蛋白質(zhì)是TGase的良好底物。乳蛋白質(zhì)經(jīng)TGase作用后，蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間交聯(lián)，形成ε-（γ-glutmayl）lys二肽，雖然胃腸道中的消化液不能將其分解，但是到達(dá)腎臟后可以被γ-谷氨酰環(huán)化轉(zhuǎn)移酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶分解為賴氨酸和谷氨酸，因此，在人體內(nèi)能被消化吸收，不會(huì)降低乳蛋白的營養(yǎng)價(jià)值[3]。Katsuya S等[4]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對經(jīng)過TGase聚合的酪蛋白進(jìn)行營養(yǎng)評價(jià)，發(fā)現(xiàn)酪蛋白聚合物中的ε-（γ-glutamyl）lys能夠被吸收。

酸奶是經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后形成的酸凝乳，但是由于溫度或物理?xiàng)l件的改變很容易出現(xiàn)乳清分離的問題。由于TGase作用形成共價(jià)鍵，提高膠體的持水力及剪切力，所以通過添加TGase可以解決這個(gè)問題，而且，它安全無毒，可以替代化學(xué)增稠劑，生產(chǎn)一種綠色產(chǎn)品。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)兩種不同酶添加方式，通過對加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶生產(chǎn)酸奶各項(xiàng)指標(biāo)的檢測，選出能改善酸奶理化特性，并且最適宜實(shí)際生產(chǎn)的酶添加方法，為后期改善酸奶的生產(chǎn)工藝提供理論根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（TG-N）酶活力是100U/g 泰興市一鳴生物制品有限公司；鮮牛奶 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)阿城牧場；蔗糖 市售食品級；氯化鈉、氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀 分析純，天津化學(xué)試劑三廠；氨水、鹽酸、95%乙醇、乙醚、石油醚、濃硫酸、硼酸 分析純，天津市進(jìn)豐化工有限公司；甲基紅、亞甲基藍(lán)、酚酞 分析純，天津市濱?？频匣瘜W(xué)試劑有限公司；海砂 化學(xué)純，上海展云化工有限公司；漢森發(fā)酵劑（嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌）；MRS培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司。

TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable M icro System公司；MAL1038384旋轉(zhuǎn)流變儀 英國MALVERN公司；SPX-150B生化培養(yǎng)箱 上海佳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Voltage 9VDC精密pH計(jì) 美國Mettler Toledo公司；AL104分析天平 美國Mettler Toledo公司；GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機(jī) 上海壘固儀器有限公司；HVE-50高壓滅菌鍋日本HIRAYAMA公司；XW-80A渦旋混勻器 上海青浦滬西儀器廠；BCD-518WS A冰箱 海爾集團(tuán)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鮮牛乳的成分測定 蛋白質(zhì)含量測定：參考GB 5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法[5]；脂肪含量測定：參考GB 5413.3-2010《嬰幼兒食品和乳品中脂肪的測定》中的第一法[6]；干物質(zhì)含量測定：參考GB 5413.39-2010《乳和乳制品中非脂乳固體的測定》中的總固體的測定[7]。

1.2.2 酶添加方式的選擇 A組為對照組：在原料乳滅菌后，冷卻至43℃，加入菌種發(fā)酵。B組為酶滅活組：原料乳滅菌后冷卻至50℃，添加谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，添加量為0.2g/L牛乳，攪拌均勻，放入保溫箱中反應(yīng)20m in，再將原料乳加熱到90℃滅酶10m in，立即冷卻至43℃接種發(fā)酵。C組為同時(shí)加酶組：原料乳滅菌后冷卻至43℃，將酶和菌種一同加入，攪拌均勻。

1.2.3 酸奶制作 酸奶的工藝流程（見圖1），從鮮牛奶處理到滅菌的操作過程，在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室乳品中試車間生產(chǎn)線中完成。鮮牛乳過濾后，加入6%的蔗糖，經(jīng)片式加熱器預(yù)熱至65～70℃，進(jìn)入均質(zhì)機(jī)，均質(zhì)壓力為18～20MPa，再經(jīng)片式加熱器90～93℃滅菌10m in。按酶滅活組和同時(shí)加酶組兩種方式分別加酶，43℃接種發(fā)酵劑發(fā)酵，當(dāng)對照組的pH達(dá)到4.3時(shí)終止發(fā)酵，進(jìn)行攪拌，分裝到150m L的無菌小燒杯中，置于4℃冰箱中貯存，每個(gè)樣品3個(gè)平行。

圖1 酸奶工藝流程Fig.1 Processing of yogurt

1.2.4 pH和滴定酸度的測定 pH的測定：使用精密pH計(jì)直接測定；滴定酸度的測定：參考GB 5413.34-2010《乳和乳制品酸度的測定》[8]。

1.2.5 硬度的測定[9]將小燒杯置于質(zhì)構(gòu)儀載物臺(tái)的中心位置，從4℃冰箱中取出酸奶立即測定，讀取硬度的最大值。質(zhì)構(gòu)儀參數(shù)：探頭AEC，盤徑35mm，壓力模式，感應(yīng)力Auto-5g，測試前速度1.0mm/s，測試速度1.0mm/s，測試后速度5.0mm/s，測試距離15mm，測試時(shí)間5s。

1.2.6 流變特性的測定[10-11]用小勺輕輕攪拌酸奶20次，取約10m L置于測試臺(tái)上，刮去周邊多余樣品，罩上鐵罩防止水分蒸發(fā)并保持溫度恒定。流變儀參數(shù)：夾具P/0.5/60mm，溫度20℃，剪切速率在180s內(nèi)從10s-1上升到50s-1，50s-1保持200s，再在180s內(nèi)從50s-1下降到10s-1。

1.2.7 持水力的測定[12]稱取酸奶6～10g于離心管中，在4℃下14000g離心30m in，傾去上清液，倒置10min稱量殘余物質(zhì)量，計(jì)算酸奶保持水分能力即持水力。

1.2.8 活菌數(shù)的測定 采用MRS培養(yǎng)基測定酸乳中乳酸菌總菌數(shù)，計(jì)數(shù)方法采用平板菌落計(jì)數(shù)法，選取菌落數(shù)在30～300之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。取0.5m L的酸奶，加入4.5m L的生理鹽水中配成1∶10的均勻稀釋液，用渦旋混勻器混勻，按10倍遞增，制成10-5稀釋液，取0.1m L 10-5稀釋液于MRS固體培養(yǎng)基中涂布，做3個(gè)平行。置（36±1）℃溫箱中培養(yǎng)（48±2）h，取出，計(jì)平板內(nèi)菌落數(shù)目。并按下公式進(jìn)行計(jì)算：

表1 酸奶感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table1 Sensory evaluation standard of yogurts

1.2.9 感官評價(jià) 酸奶成熟后，邀請10位經(jīng)過培訓(xùn)的食品研究人員品嘗，從色澤、滋味和氣味、組織狀態(tài)、黏度4方面對貯存7d的酸奶樣品進(jìn)行感官評定，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)中酸奶的評定辦法[9，13]，制定評定標(biāo)準(zhǔn)，評定總分為100分，評定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件、Origin 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算及分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸奶酸度和菌數(shù)的變化

2.1.1 酸度變化 從圖2中可以看出，A為對照組在發(fā)酵8h（1/3d）后pH達(dá)到4.3，而B為酶滅活組pH為4.38，C為同時(shí)加酶組pH為4.33。在貯存期間A的pH最低，且滴定酸度最高，B和C的pH、滴定酸度相差不大。所有樣品pH在貯存期間不斷降低，滴定酸度不斷升高，直到21d趨于平穩(wěn)。

圖2 酸奶酸度的變化Fig.2 Variations in the acidity of yogurts

上述結(jié)果表明加酶后的酸奶發(fā)酵時(shí)間需要延長，這可能是由于蛋白質(zhì)的交聯(lián)導(dǎo)致乳酸菌的共生關(guān)系輕微失衡[14]，在貯存期間，加酶的酸奶樣品后酸化較弱，可能與蛋白質(zhì)交聯(lián)時(shí)利用乳中的多肽或氨基酸，導(dǎo)致乳酸菌生長所需營養(yǎng)物質(zhì)不足有關(guān)，菌體生長緩慢，產(chǎn)酸較少。根據(jù)SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析得知，樣品A與B、C之間滴定酸度值差異顯著（p＜0.05），說明TGase對酸奶的酸度影響顯著。

2.1.2 活菌數(shù)變化 由圖3可知，與樣品A相比，樣品B和C的活菌數(shù)明顯較少。所有樣品的活菌數(shù)在第21d開始減少，樣品A、C下降平緩，樣品B下降迅速，F(xiàn)aergemand等[15]也曾報(bào)道在發(fā)酵前對TGase酶滅活對乳酸菌的生長有顯著影響，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與其一致。

圖3 貯存期間菌數(shù)的變化Fig.3 Variations in the counts of lactic acid bacteria colonies during storage of yogurts

從上述結(jié)果可以看出，TGase酶對菌種的生長有顯著影響。TGase是安全無毒的，所以對乳酸菌影響的唯一可能是乳酸菌生長所需的小分子質(zhì)量的多肽或氨基酸被TGase酶交聯(lián)，導(dǎo)致部分不可被乳酸菌利用，生長受到影響[14]。

2.2 硬度和流變特性的變化

2.2.1 硬度變化 從圖4可以看出，硬度總體呈先上升后下降的趨勢，經(jīng)TGase酶處理的樣品硬度都高于對照組，與樣品A相比，樣品B的硬度在儲(chǔ)存期間比較穩(wěn)定，上升和下降的趨勢平緩，在14d達(dá)最大值39.55g，而樣品C的硬度提高幅度較大，且變化趨勢明顯，在21d硬度達(dá)到最大值45.05g后開始下降。樣品A與樣品B和C的硬度差異極顯著（p＜0.01）。

TGase酶對酸奶硬度的影響極顯著，這是由于TGase催化交聯(lián)乳蛋白，主要在分子間形成酪蛋白低聚物，增強(qiáng)了酸奶的凝膠強(qiáng)度[16]。在酶的用量相同，對酶的處理方式不同時(shí)，TGase不滅活可以較大程度的提高酸奶的硬度，而且在后期TGase酶的活力也會(huì)減弱，對酸奶的結(jié)構(gòu)狀態(tài)不會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響。在實(shí)際生產(chǎn)中，不滅活酶的方法更實(shí)用。

圖4 貯存期間硬度變化Fig.4 Variations in the hardness during storage of yogurts

2.2.2 流變特性的變化 攪拌型酸奶是具有非牛頓剪切稀化特性的流體，隨著剪切速率的增大，剪切應(yīng)力呈先快后慢增加趨勢，當(dāng)剪切速率降低時(shí)，剪切應(yīng)力呈降低趨勢，但兩條曲線不會(huì)重合，趨勢降低的曲線應(yīng)力小于趨勢增加的曲線的應(yīng)力，兩條曲線之間的環(huán)面積（滯回曲線面積）反映破壞流體結(jié)構(gòu)所需能量[9]。

圖5 貯存7d剪切應(yīng)力的變化Fig.5 Variations in the shearing stress after 7d storage

從圖5～圖8可知，C組的剪切應(yīng)力最大，在貯存期間呈上升趨勢，樣品A的剪切應(yīng)力最小。與樣品A相比，樣品B的剪切應(yīng)力提高不明顯。攪拌型酸奶的剪切應(yīng)力是蛋白質(zhì)、乳酸菌體和胞外多糖相互結(jié)合的結(jié)果，蛋白質(zhì)是酸奶中最主要的成分，也是應(yīng)力產(chǎn)生的主要原因[9]，加入TGase酶后，乳蛋白發(fā)生交聯(lián)，形成了穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)，增大了酸奶的剪切應(yīng)力。經(jīng)Origin 6.0軟件計(jì)算，樣品C的環(huán)面積最大，樣品B次之，樣品A最小。滯回曲線區(qū)域差異說明，經(jīng)TGase酶交聯(lián)的酸奶對剪切力形成了一個(gè)更穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)。

圖6 貯存14d剪切力的變化Fig.6 Variations in the shearing stress after 14d storage of yogurts

圖7 貯存21d剪切力的變化Fig.7 Variations in the shearing stress after 21d storage of yogurts

圖8 貯存28d剪切力的變化Fig.8 Variations in the shearing stress after 28d storage of yogurts

2.3 持水力的變化

持水力（WHC）是表示酸奶離心后所能保留的水分，大多是與凝膠中大分子結(jié)合較牢固的水分子，凝膠立體網(wǎng)絡(luò)中的毛細(xì)管束縛的自由水大多被除去。WHC越高說明此凝膠體系中的大分子可以通過較強(qiáng)的作用力結(jié)合較多的水分子，產(chǎn)品中結(jié)合水的含量也越高，乳清析出越少[17]。

樣品A在第1d的持水力為30.01%，在第28d達(dá)到33.01%，增幅為3%，樣品B和樣品C第1d的持水力分別為29.87%、30.93%，增幅分別為5.13%、5.41%，樣品C的增幅最大。由圖9也可以看出，隨貯存時(shí)間的延長，酸奶持水力不斷增加，兩種酶處理方法都可以改善酸奶的結(jié)構(gòu)，樣品C能顯著提高酸奶的持水力，而且不需要對酶滅活，更符合實(shí)際生產(chǎn)。

圖9 貯存期間持水力的變化Fig.9 Variations in theWater holding capacity during storage of yogurts

2.4 感官評價(jià)

感官評定結(jié)果如表2所示。

酸奶樣品呈乳白色，顏色分布均勻，奶香純正，酸甜適口，無不良?xì)馕?，無乳清析出。雖然三種樣品在色澤、滋氣味、組織狀態(tài)的差別不大，總分也比較接近，但還是有一定的差異性。在色澤上，樣品A、B，樣品B、C兩兩差異不顯著，樣品A、C差異顯著；在滋氣味方面三種樣品差異不顯著；在組織狀態(tài)上，樣品A、B差異不顯著，但都與樣品C差異顯著；在黏度上，三種樣品之間的差異均顯著，樣品C最粘稠。經(jīng)綜合評價(jià)，樣品C品質(zhì)最優(yōu)。

3 結(jié)論

表2 酸奶感官評定結(jié)果（n=10）Table2 Sensory evaluation resultof yogurts（n=10）

通過TGase交聯(lián)乳蛋白來提高酸奶的理化特性是一種替代酸奶中加入穩(wěn)定劑的好方法。TGase酶可以提高酸奶的硬度、持水力、剪切應(yīng)力及感官特性，然而對乳酸菌的生長有不利影響，導(dǎo)致發(fā)酵時(shí)間的稍微延長。

通過對酸奶各項(xiàng)理化指標(biāo)的測定和比較，發(fā)現(xiàn)在巴氏殺菌后將TGase酶與發(fā)酵劑同時(shí)加入，可以更顯著提高酸奶的理化特性，在貯存后期TGase酶活力減弱，對酸奶的質(zhì)構(gòu)無不良影響，而且不需要額外的酶反應(yīng)時(shí)間，熱處理工序及設(shè)備，符合實(shí)際生產(chǎn)要求。

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