■樊 振 買爾哈巴·艾合買提 美合熱阿依·木臺力甫 烏斯?jié)M·依米提

（新疆大學生命科學與技術(shù)學院，新疆烏魯木齊 830046）

在青貯飼料的生產(chǎn)中，乳酸菌起到了舉足輕重的作用，它能在發(fā)酵過程中迅速繁殖并產(chǎn)生大量的乳酸和乙酸，進而迅速降低青貯環(huán)境的pH值，并結(jié)合周圍的無氧條件抑制了霉菌、酵母菌等有害菌的活動，從而達到保持飼料營養(yǎng)品質(zhì)和長期存貯的目的[1]。

然而，在實際生產(chǎn)中由于受路途遙遠、試驗條件差等客觀因素的制約，乳酸菌青貯添加劑粉劑化顯得尤為必要。在諸多菌粉制作技術(shù)中，真空冷凍干燥法生產(chǎn)的發(fā)酵劑由于含活菌數(shù)高、發(fā)酵活力強、遺傳性穩(wěn)定、便于儲藏、攜帶方便、使用安全等優(yōu)點而被廣泛使用[2-3]。而關于乳酸菌凍干的報道，在食品方面較多，但在飼料上卻鮮有提及。

要制作優(yōu)良的凍干發(fā)酵劑，其中涉及兩個關鍵：即增加菌液的濃縮程度和減少干燥致死的數(shù)量[4]。在制作凍干粉劑的過程中，菌體細胞的分離技術(shù)是一個重要的中間環(huán)節(jié)。離心分離時，由于離心力機械作用和離心時間的影響，如果離心條件掌握不當，菌體死亡率和損失率會隨之增高，故而選用合適的離心條件是非常必要的[5]。凍干是一個多步驟過程，會產(chǎn)生多種應力，如低溫應力、凍結(jié)應力和干燥應力等，會使細菌變性。然而凍干保護劑可以改變樣品在冷凍干燥時的物理、化學環(huán)境，減輕或防止干燥和復水對細胞的損傷，盡可能保持原有的各種生理生化特性和生物活性[6]。

本文所選用菌株均為從吐魯番地區(qū)玉米青貯飼料上分離得到。選用的保護劑為大分子保護劑、小分子保護劑和抗氧化物搭配使用，以期能得出保護效果最佳的保護劑配方。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設備

MRS培養(yǎng)基：用于以上菌株的增殖培養(yǎng)。

抗壞血酸、海藻糖、甘油均為分析純，脫脂乳為市售脫脂奶粉。

儀器設備：真空冷凍干燥機、高速離心機。

1.2 試驗設計

1.2.1 試驗流程

單個菌落→活化→初次擴培→二次擴培→離心收集菌體→加入保護劑→活菌計數(shù)(cfu/ml)→分裝預凍(-20℃，12 h)→冷凍干燥→復水處理(10%脫脂乳，2 h)→計活菌數(shù)(cfu/ml）→計算凍干存活率。

1.2.2 菌體的收集和細胞懸浮液的制備

離心條件的選擇：為了使樣品凍干時有足夠的菌體，分別選擇不同的轉(zhuǎn)速和時間進行離心，然后通過測活菌數(shù)來確定收集高濃度菌體所需要的離心條件。

懸浮液制備：用以上方法得出的最佳離心條件將菌液離心后去上清液，然后將不同保護劑分別加入菌體沉淀中，懸浮液制備好后測活菌數(shù)。

軟件開發(fā)過程實現(xiàn)開放化管理，也就是實現(xiàn)對資源的共享，通過公開軟件源代碼，使得軟件產(chǎn)品的標準化工作逐步被推動起來，軟件的兼容性問題能夠進一步提高，進而能夠達到對資源共享的目的。同時，軟件開發(fā)設計人員在未來可以實現(xiàn)彼此之間的相互交流，實現(xiàn)共同進步，也可以彼此之間通力合作，實現(xiàn)計算機軟件行業(yè)的不斷可持續(xù)發(fā)展。

1.2.3 冷凍干燥存活率的測定

活菌數(shù)測定：吸取0.5 ml待測菌液用滅菌的生理鹽水進行10倍梯度稀釋，選擇適當?shù)南♂屘荻龋?00 μl菌懸液置于平板內(nèi)，加入15 ml左右的MRS培養(yǎng)基混勻，每個稀釋梯度3個平行。平板在37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，選擇菌落數(shù)在30～300之間的平板進行計數(shù)。

存活率計算公式[7]：

2 結(jié)果與討論

2.1 離心法收集菌體細胞

本試驗用不同的離心力和不同的離心時間，篩選出了兩株菌分別要獲得最大活菌數(shù)所需的離心條件，試驗結(jié)果如圖1和圖2所示。

圖1 離心條件對植物乳桿菌離心效果的影響

圖2 離心條件對腸膜狀明串株葡聚糖亞種離心效果的影響

通過比較離心條件對兩株菌離心效果的影響，可以得出兩株菌均在5 000 r/min的條件下離心10 min，所得的活菌數(shù)最高。L.P（植物乳桿菌）活菌數(shù)可達1.14×1012cfu/g，而L.D(腸膜狀明串株葡聚糖亞種)活菌數(shù)可達7.2×1011cfu/g。

在離心分離過程中，一方面，部分菌體殘留于上清液中造成損失；另一方面，由于離心力的作用造成的機械損傷會使部分菌體死亡。如果離心工藝掌握不當，必然導致發(fā)酵劑中活菌含量的下降。田洪濤（1998）在離心雙歧桿菌時發(fā)現(xiàn)，在采用“低速長時”或“高速短時”離心時，離心損失率明顯下降，收獲的活菌數(shù)最多[8]。本試驗所得結(jié)果與其得出的結(jié)論基本一致。

2.2 正交試驗優(yōu)化凍干保護劑

本試驗采用4因素3個水平的正交試驗L9(34)來確定4種保護劑：海藻糖、脫脂奶粉、抗壞血酸和甘油的復合配方，正交試驗的因素水平設計見表1，試驗結(jié)果見表2和表3。如表2和表3所示，4種保護劑在單因素試驗中都有很好的保護效果。

表1 正交試驗因素水平設計

表2 植物乳桿菌凍干保護劑的篩選

表3 腸膜狀明串株葡聚糖亞種凍干保護劑的篩選

由表2的試驗結(jié)果可以看出，影響植物乳桿菌凍干存活率的因素從大到小為A＞B＞D＞C,脫脂乳的效果最為明顯，甘油效果較差。通過優(yōu)化凍干保護劑的正交試驗結(jié)果，可以得到植物乳桿菌的最佳保護劑配方為：脫脂乳15%、海藻糖6%、甘油2%，抗壞血酸3%（以上均為質(zhì)量分數(shù)）。植物乳桿菌在使用此保護劑的情況下凍干存活率可達到88.21%。

由表3的試驗結(jié)果可以看出，影響腸膜狀明串株葡聚糖亞種凍干存活率的因素從大到小為A＞B＞D＞C,其中脫脂乳的效果最為明顯，甘油效果較差。通過優(yōu)化凍干保護劑的正交試驗結(jié)果，可以得到腸膜狀明串株葡聚糖亞種的最佳保護劑配方為：脫脂乳15%、海藻糖6%、甘油1%、抗壞血酸2%（以上均為質(zhì)量分數(shù)）。腸膜狀明串株葡聚糖亞種在使用此保護劑的情況下凍干存活率可達到90.02%。

保護劑可以減少冷凍干燥引起的微生物細胞的損傷。配制保護劑時應當注意保護劑材料的搭配[9]。一般來說，保護劑大體上可以分為兩類：一類為小分子化合物，如氨基酸、醇類和糖類等；另一類為大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、可溶性淀粉等。原則上小分子保護劑搭配大分子保護劑就能獲得良好的保護效果。

脫脂乳作為最常見的一種保護劑，其多種成分可以在凍干過程中起保護作用，如其中的乳清蛋白能夠在菌體外形成蛋白膜，對細胞加以保護，并可以固定凍干的酶類，防止由于細胞壁蛋白質(zhì)的損壞而引起的胞內(nèi)物質(zhì)泄漏[10]。在本試驗中，脫脂乳在兩株菌的凍干過程中起的作用也最為明顯。近年來，海藻糖的保護作用日益被人們所重視，關于海藻糖對生物分子的保護作用，大致有兩種假說，一是“玻璃態(tài)”假說，該假說認為通過海藻糖玻璃化轉(zhuǎn)變的趨勢，使細菌在冷凍干燥過程中和復水過程中均處于液晶狀態(tài)，在這種結(jié)構(gòu)中，分子運動和分子反應非常微弱[11]。二是“水替代”假說，該假說認為當生物大分子失去包圍在其表層以維持其結(jié)構(gòu)和功能的水膜時，海藻糖能在失水部位以氫鍵形式連接，形成一層保護膜以代替失去的結(jié)構(gòu)水膜，來維持生物大分子的空間結(jié)構(gòu)[12]。而甘油作為一種小分子保護劑，凍干時在胞內(nèi)起如下作用：一是改變了胞內(nèi)的過冷狀態(tài)，使胞內(nèi)外壓力接近，降低了細胞脫水縮皺程度和速度；二是小分子保護劑能順利進出細胞，緩解了因復水引起的滲透性腫脹而帶來的損傷?？箟难嶙鳛橐环N抗氧化劑，能降低保護劑的氧化還原電位，并消耗試驗過程中的部分氧氣，防止對菌體有害的胺基羥基反應或氧化作用，保持了細胞活性并提高穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

通過優(yōu)化凍干保護劑的正交試驗結(jié)果，可以確定植物乳桿菌的最佳保護劑配方為：脫脂乳15%、海藻糖6%、甘油2%、抗壞血酸3%，此時植物乳桿菌的凍干存活率可達到88.21%。腸膜狀明串株葡聚糖亞種的最佳保護劑配方為：脫脂乳15%、海藻糖6%、甘油1%、抗壞血酸2%，此時腸膜狀明串株葡聚糖亞種的凍干存活率可達到90.02%。

本試驗所選用的4種保護劑具有較好的互補作用，脫脂乳主要在細胞表面起保護作用；甘油能滲透到細胞內(nèi)部；海藻糖在干燥過程中形成一種玻璃態(tài)，由于極高的黏度使得分子擴散系數(shù)很低，降低了細胞壁的通透性；最后結(jié)合抗氧化性能良好的抗壞血酸，使得乳酸菌在凍干后存活率大大提高，從而克服了如路途遙遠、活菌數(shù)不足、飼養(yǎng)地區(qū)試驗條件差等因素的制約，為青貯飼料添加劑在農(nóng)牧區(qū)的推廣提供了現(xiàn)實依據(jù)。