葛澤河,孫師師綜述,馬洪波審校

(吉林醫(yī)藥學院營養(yǎng)教研室，吉林 吉林 132013)

·綜 述·

降血脂的評價體系

The evaluation system of lowering blood lipid

葛澤河,孫師師綜述,馬洪波*審校

(吉林醫(yī)藥學院營養(yǎng)教研室，吉林 吉林 132013)

本文將降血脂評價體系進行初步分類，主要分為動物模型評價體系和體外評價體系兩大類。并分別對兩個評價體系進行介紹和特點總結，以展示不同評價體系在降血脂評價過程中的建立方法、評價方式及其利弊。

血脂；評價；綜述

近年來，人們生活水平有了顯著提高，健康問題已成為人們關注的熱點。其中高血脂癥在我國發(fā)病率逐年增高，成為主要威脅人類健康的疾病之一。高血脂癥可引發(fā)動脈粥樣硬化(AS)，造成高血壓和心腦血管等疾病。因此開發(fā)各類降血脂藥品、保健品、食品成為當前研究的熱點。開發(fā)研究降血脂產(chǎn)品，離不開降血脂評價體系的建立。目前，常用降血脂效果的評價方法大致可分為兩類，即降血脂動物模型和降血脂體外評價體系。在此將對兩大類降血脂評價體系進行相關介紹。

1 降血脂動物模型

1.1模型建立

1.1.1材 料

降血脂動物模型的建立常采用的動物有雄性大白兔、雄性Wistar大鼠或SD大鼠等。兔是最早用于高脂血癥和AS研究的動物。大鼠代謝較穩(wěn)定，且血量充足，造成高血脂動物模型的成功率高。因此在降血脂保健食品和藥品研究中通常采用大鼠制備高血脂模型。高瑩等[1]比較了SD大鼠和Wistar大鼠的血清和肝臟制止對于高脂飼料(1%膽固醇、10%豬油和79%基礎飼料)的反應。實驗結果顯示SD大鼠在TG增高水平上顯著高于Wistar大鼠,提示SD大鼠可能是較好的高甘油三酯血癥模型。也有用小鼠來制備高血脂模型，用以評價降血脂效果。雖然小鼠的代謝情況與大鼠有很大不同，但有實驗證明，在降血脂保健食品功能評價實驗中，用小鼠代替大鼠建立動物模型基本上是可行的。而且小鼠與大鼠相比可大大降低實驗經(jīng)費和飼育空間。故在降血脂功能材料的篩選等研究中，可先使用小鼠來摸索條件，再以大鼠做精準檢測與評價，可大大提高實驗精度[2]。此外，還有文獻報道將鵪鶉、猴、雞、鴿子以及貴州小型豬用于高血脂動物模型的建立。

1.1.2方 法

目前，降血脂評價體系中制備高血脂動物模型基本分為3類[3]。一是先天性動物模型，即通過動物幼年期的誘導高血脂癥的建模方式;二是化學物質(zhì)誘導的動物模型;三是通過轉(zhuǎn)基因技術建立的高血脂動物模型。先天性動物模型是基于其本身發(fā)育不全或者可遺傳基因突變所形成的高血脂動物模型，如出生25 d的乳幼大鼠，在不脫離母鼠乳汁喂養(yǎng)的前提下，由于乳汁中脂肪含量高且幼鼠甲狀腺功能尚不健全等原因，導致乳幼大鼠的甘油三酯(TG)含量一般為成年大鼠的2～3倍。20世紀70年代初，度邊氏發(fā)現(xiàn)了一種具有遺傳性高脂血癥的家兔，由于該種家兔攜帶一個可遺傳的變異基因，而導致體內(nèi)缺少低密度脂蛋白受體(LDL-R)，出現(xiàn)高脂血癥，即為WHHL(Watamabe Heritable Hyperlipidemic)，與人類的家族性高脂血癥(FH)相類似。所以在研究人類HF的過程中WHHL有著極為重要的作用。轉(zhuǎn)基因動物模型主要采用的是小鼠，因為小鼠在遺傳學上有著明確的野生品種且有多種突變型和重組型的品種。其中轉(zhuǎn)基因小鼠常用于調(diào)控載脂蛋白基因的表達，其中以ApoE研究較多。3種方法中以化學物質(zhì)誘導最為常用?；瘜W物質(zhì)誘導具體常用的方法有表面活性劑法、同型半胱氨法、免疫學法、轉(zhuǎn)基因法及高脂飼料喂養(yǎng)法等[4],其中最為常用的是高脂飼料喂養(yǎng)法。具體方法有兩種，一是將膽固醇、蛋黃粉、豬油等摻入基礎飼料中，由實驗動物自由采食。多數(shù)實驗表明，高脂飼料喂食4～5周即可得高血脂動物模型。高奮等[5]在用兔進行高血脂癥模型建立中，顯示高脂飼料喂養(yǎng)家兔第4周時高脂組各項血脂均顯著高于對照組，而到第8周各項指標與第4周無顯著差異(P>0.05)。二是以高脂乳劑對實驗動物進行每日灌胃，灌胃時間一般視動物類型而定。多數(shù)實驗表明大鼠灌胃7～9 d，大鼠血清膽固醇(TC)、TG、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)均有明顯升高，即高血脂動物模型建立。此外，還有通過給小鼠腹腔注射75%的蛋黃乳劑0.5 mL建立高膽固醇血癥的模型。Makoto等[6]通過給兔用靜脈注射環(huán)磷酰胺(65 mg/kg)誘導兔形成高脂血癥的造模方法。

1.2評價方法

降血脂評價體系應由正常對照組、高血脂動物模型組和實驗組3組構成。正常對照組和高血脂動物模型組予以基礎飼料，實驗組予以基礎飼料同時，予以待評價降血脂物質(zhì)。飼育各實驗組動物一定時間后，采用眶靜脈或尾靜脈取血，分離血清，測定血清血脂的各項指標，主要包含TG、TC、 LDL-C和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量變化[7]。TG和TC是血漿脂質(zhì)的主要成分，但是只檢測這兩項是不足以反應血脂的代謝水平的。所以需要進一步測定LDL-C和HDL-C的濃度，LDL-C濃度的升高和低水平的HDL-C將加大患AS的幾率。所以為較全面的測定血脂的代謝水平，以上4個指標的檢測是必不可少的。也有取實驗動物肝臟樣品，測定肝組織超氧化物歧化酶(SOD)活力、組織中丙二醛(MDA)含量的改變[8]。SOD是超氧陰離子自由基的清除劑，可抑制自由基啟動的脂質(zhì)過氧化。而MDA能使膜蛋白、酶發(fā)生交聯(lián)反應,使膜通透性增加，導致細胞膜結構、功能和代謝發(fā)生改變，對機體造成損害。王一心等[9]測定TC、LDL-C、HDL-C、TG時采用酶法，MDA采用硫代巴比妥酸(TBA)法；SOD采用黃嘌呤氧化酶法。張素英[10]測定TC使用的是酶比色法(CHOD-PAP)、TG使用的是酶比色法(GPO-PAP)、HDL-C使用的是磷鎢酸-鎂沉淀法(PTA-Mg)、LDL-C使用的是聚乙烯硫酸沉淀(PVS)。將實驗組的各項指標與高血脂動物組進行比較，根據(jù)各項指標的變化所反映的血脂代謝水平，綜合評價所用降血脂物質(zhì)的降血脂效果。

1.3動物模型評價體系的利弊

降血脂動物模型比較符合人類高脂血癥形成特點，適合于高脂血癥研究，且此類評價體系的建立具有操作簡單、技術方法成熟等優(yōu)點。但是，由于實驗動物在攝食量上不易控制，實驗動物本身存在一定的個體差異，所以建立起的高血脂動物模型在血脂水平上有著較大的個體差異。劉明等[11]為減少個體間的血脂水平差異，采用了脂肪乳化劑給大鼠每日灌胃。但由于建模中大鼠容易腹瀉，且脂肪乳化劑的表面張力大，造成灌胃困難，對大鼠損傷大，所以影響大鼠高血脂癥的形成。此外，降血脂動物模型建立還有花費較大、實驗周期長、不適宜降血脂化合物的快速篩選等不足之處。

2 降血脂體外評價體系

2.1評價體系建立

2.1.1材 料

降血脂體外評價技術目前所用材料有體外培養(yǎng)的各類細胞和人體內(nèi)各類可發(fā)揮降脂作用的受體，以及各類參與脂代謝的酶與蛋白質(zhì)等。其中細胞采用的有血管平滑肌細胞源性荷脂細胞、3T3-L1脂肪細胞[12]、結腸腺癌細胞(Caco-2細胞)等。Nagaoka等[13]采用Caco-2細胞建模，發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶水解后的β-乳球蛋白多肽可明顯降低Caco-2細胞對TC的吸收。受體采用的有低密度脂蛋白受體LDL-R、巨噬細胞清道夫受體(SR)與脂質(zhì)代謝相關的核受體(nuclear receptor)等。LDL-R在調(diào)節(jié)LDL代謝和保持血液中TC正常濃度方面有很重要的意義。LDL-R基因的激活表達，是降低血液中LDL的一種途徑。SR是吞噬細胞表面的一組異質(zhì)性分子。在AS的研究中表明，SR是介導細胞攝取ox-LDL 的主要途徑。核受體是一類配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子。核受體家族成員眾多，目前主要包括3大類：類固醇受體,非類固醇激素受體,孤兒核體。大量研究表明，核受體對脂肪酸和TC代謝、TC轉(zhuǎn)運以及血漿載脂蛋白水平均有調(diào)控作用，通過調(diào)節(jié)核受體的活性可以實現(xiàn)對其目的基因表達的調(diào)控，從而達到調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的目的。針對各類參與脂代謝的酶與蛋白質(zhì)主要包括HMG-CoA還原酶、脂蛋白脂肪酶、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白等，通過對它們相應抑制劑的研究，從而對降血脂成分進行初步的篩選。例如，Tsukasa等人[14]從微生物代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的角鯊烯合成酶抑制劑，在降低血漿TC水平的同時還能降低血漿的TG水平。

2.1.2方 法

以體外培養(yǎng)細胞建立高血脂模型可以通過用基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時間后，再用含高TC、油酸等培養(yǎng)基培養(yǎng)一定時間后，可得到不同高脂類型的細胞模型。牛玉存等人[15]用以上方法以HepG2細胞分別建立了高TC細胞模型和高TG細胞模型。并通過向培養(yǎng)液中加入5-羥膽固醇后，細胞內(nèi)TC含量顯著升高，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶、固醇類元件結合蛋白-2(SREBP-2)及LDL-R表達降低，表明TC模型成功。通過向培養(yǎng)液中加入油酸6 h后油酸吸收率達到40%，細胞內(nèi)TG有升高趨勢即表明高TG模型成功。模擬人體內(nèi)各類可發(fā)揮降脂作用的受體建立模型，實質(zhì)上是通過誘導或抑制細胞或微生物中的該類受體相關基因的表達來建立相關受體篩選模型，用以篩選其相關受體激動劑或阻斷劑。此外應用較多的還有建立體外模擬膽汁膠束的體外降血脂評價體系。江錕等人[16]通過膽汁酸結合試驗驗證了鱸魚活性肽的體外降血脂活性。

2.2評價方法

將需要評價的降血脂物質(zhì)加入建立的高血脂細胞培養(yǎng)液中，作用一定時間后，測定細胞中TC和TG的含量。人體的脂代謝中有兩種最有效、最直接的降TC方式。一種是通過抑制HMG-CoA還原酶的活性來抑制膽固醇的合成[17]。二是通過提高LDLR的水平來增加LDL-C的清除率。其中血液中的LDL-C是血漿中主要攜帶TC的載脂蛋白，所以血液中的LDL-C濃度升高可增加心血管疾病的患病率。SREBP-2為LDL-R基因的主要調(diào)節(jié)蛋白，SREBP-2可以激活LDL-R基因的表達和膽固醇合成關鍵基因的表達。所以在進行體外評價時需要測定包括細胞內(nèi)HMG-CoA還原酶、血液中LDL-R及SREBP-2等物質(zhì)的表達情況。若細胞內(nèi)TC和TG的含量較未加入該降血脂物質(zhì)前有所下降，且HMG-CoA還原酶、LDL-R等較之前有所升高，則顯示該降血脂物質(zhì)有效。否則，顯示該物質(zhì)的降血脂效果尚待進一步研究確定。對于受體篩選模型，經(jīng)待評價降血脂物質(zhì)作用后，以熒光素酶基因為報告基礎，最終通過檢測熒光酶的表達量間接反應該降血脂物質(zhì)的降血脂效果。通過體外模擬膽汁膠體束建立的評價體系，由于阻斷膽汁酸的肝膽循環(huán)可阻斷TC的重吸收，故測定膽汁酸的結合能力可用于評價物質(zhì)的降血脂效果。

2.3體外評價體系的利弊

體外評價體系建立較為快速、簡便，且評估結果具有很好的針對性。并且現(xiàn)有的體外評價方法可從脂肪/TC的幾個不同代謝途徑考察降血脂物質(zhì)的功效，可達到降血脂成分初步篩選的目的。但體外評價體系所獲結果比較單一，始終不能模擬人體內(nèi)復雜的代謝環(huán)境。所以評價結果難免的存在片面性，難以完全證實被評價物在人體內(nèi)也能發(fā)揮其在體外發(fā)揮同等的降血脂效果。

3 結 語

目前為止，國內(nèi)常采用的降血脂評價方法主要是建立降血脂動物模型。但是，近幾年也有不少研究者嘗試建立各種降血脂體外評價體系，并取得了一定成果。但是無論是哪種評價體系都存在其局限性，單獨采用一種評價體系所得結果存在一定局限性，所以，可以在今后的研究中考慮先用體外評價體系進行高速篩選，再用動物模型模擬人體的代謝過程，從而進行進一步的研究。這樣不僅可以節(jié)約大量研究時間和經(jīng)費，還可以互補不同評價體系之間的利弊，提高結果的置信度。

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R589.2

A

2013-09-06)

1673-2995(2013)06-0463-04

吉林省教育廳“十二五”科研資助項目(2013360).

葛澤河(1991-)，男(漢族)，在讀本科.

馬洪波(1969-)，男(漢族)，副教授，碩士.