武鵬，趙大千，蔡歡歡，王芳，高悅勉

(1.大連海洋大學(xué) 遼寧省水生生物學(xué)重點實驗室，遼寧 大連116023;2.大連金砣水產(chǎn)食品有限公司，遼寧 大連116400)

微生態(tài)制劑又稱益生菌，Kozasa［1］首次將其應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖，此后得到迅速推廣。已有研究表明，微生態(tài)制劑對刺參生長和免疫有良好的改善作用［2-9］。微生態(tài)制劑，不僅可以降解水中氨氮、亞硝酸氮和硫化氫等有害物質(zhì)，還能改善養(yǎng)殖對象腸道微生態(tài)環(huán)境和分泌消化酶，提高飼料轉(zhuǎn)化率，預(yù)防疾病，促進(jìn)生長［10］。本試驗中，作者研究了3種微生態(tài)制劑在不同濃度下對水質(zhì)、刺參Apostichopus japonicus 幼參生長和免疫的影響，旨在為其在刺參養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用幼刺參(簡稱幼參)由大連金砣水產(chǎn)食品有限公司提供，幼參規(guī)格一致，鮮體質(zhì)量為(0.7053 ±0.0046)g。

3種微生態(tài)制劑為免疫增強(qiáng)劑、復(fù)合芽孢桿菌和EM 菌，其中免疫增強(qiáng)劑主要成分為枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、乳酸片球菌、產(chǎn)朊假絲酵母等活菌(60 ×108cfu/mL)以及免疫肽、氨基酸和獨特生物活性因子，為深褐色液體，購自青島綠海洋生物技術(shù)有限公司;復(fù)合芽孢桿菌主要成分為多種有益芽孢桿菌(30 ×108cfu/mL)，為白色液體，購自大連神龍生物技術(shù)有限公司;EM 菌主要成分為海洋芽孢桿菌、海洋放線菌、海洋酵母等(50 × 108cfu/g)，為紅色固體粉末，購自濰坊東方海洋生物科技研發(fā)中心。生產(chǎn)上，一般將EM 菌加水配制成菌液后使用，1 g/m3(固體粉末)≈1 mL/m3(液體菌液)。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計與日常管理 試驗設(shè)9 個處理組，其中A1、A2、A3 處理組分別投喂添加濃度為2、4、8 mL/m3的免疫增強(qiáng)劑飼料;B1、B2、B3 處理組分別投喂添加濃度為2、4、8 mL/m3的復(fù)合芽孢桿菌飼料;C1、C2、C3 處理組分別投喂添加濃度為2、4、8 mL/m3的EM 菌飼料;另設(shè)1 個對照組，只投喂基礎(chǔ)飼料(主要成分為大葉菜藻液)。由于條件限制，每組設(shè)2 個重復(fù)。試驗在100 L 的PVC 塑料桶中進(jìn)行，試驗水體為80 L，每桶放35頭幼參。日投餌2次(7:00、17:00)，投餌量為幼參體質(zhì)量的5%。上午觀察幼參的攝食情況，確定投餌量，下午清除殘餌和糞便。日換水1次，換水量為水體的1/5，換水后將微生態(tài)制劑直接潑灑至水體中。試驗期間，水溫為12 ～16 ℃，鹽度為31 ～32，連續(xù)充氣。每隔12 d(換水前)測定水體中的pH 值及和含量。試驗共進(jìn)行60 d。

1.2.2 水質(zhì)檢測 用pHS -25 型測定儀測定pH值，采用納氏比色法測定含量，采用萘乙二胺分光光度法測定含量［11］。

1.2.3 生長指標(biāo)的測定 試驗結(jié)束24 h 后，對每組幼參總體質(zhì)量進(jìn)行稱量，計算特定生長率(SGR)和成活率:

式中:W0和Wf分別為試驗初始和終末時幼參的均體質(zhì)量(鮮質(zhì)量，g);t 為試驗時間(d)。

1.2.4 體腔液中免疫酶活力的測定 試驗結(jié)束24 h 后，從每組隨機(jī)挑選幼參5 頭，抽取體腔液測定其免疫酶活力。

以羊腿股二頭肌為取樣點，每組分別從原料腿（0 d）、腌制結(jié)束（3 d）、風(fēng)干前期（8 d）、風(fēng)干中期（15 d）、風(fēng)干后期（23 d）、成熟期（30 d）等六個工藝點取樣，置于-20 ℃冷凍保藏，以備各指標(biāo)的測定。

酸性磷酸酶(ACP)的測定:ACP 分解磷酸苯二鈉，產(chǎn)生游離酚和磷酸，酚在堿性溶液中與4-氨基安替吡啉作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物，根據(jù)紅色深淺測定酶活力的高低。酶活力定義:100 mL 體腔液在37 ℃下與底物作用30 min，產(chǎn)生1 mg 酚為1 個酶活力單位。

過氧化氫酶(CAT)的測定:CAT 分解H2O2的反應(yīng)可通過加入鉬酸銨而迅速中止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物，在405 nm 處測定其生成量，據(jù)此可計算出CAT 的活力。酶活力定義:每毫升體腔液每秒鐘分解1 μmol H2O2的量為一個酶活力單位。

溶菌酶(LSZ)的測定:一定濃度的混濁菌液中，由于LSZ 能水解細(xì)菌細(xì)胞壁上肽聚糖使細(xì)菌裂解而濃度降低，透光度增強(qiáng)，然后根據(jù)透光度的變化來推測LSZ 的含量。

以上3種酶活力均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的專用試劑盒進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以平均值± S.E.表示，用SPSS 11.7 軟件進(jìn)行相關(guān)性檢驗、方差分析和LSD 多重比較，以P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生態(tài)制劑對養(yǎng)殖水體水質(zhì)的影響

2.1.1 pH 值 整個養(yǎng)殖過程中，處理組和對照組養(yǎng)殖水體中的pH 值都在7.6 ～7.8 之間波動，各組間均無顯著性差異(P ＞0.05)。

表1 不同試驗時期3種微生態(tài)制劑對養(yǎng)殖水體中含量的影響Tab.1 The effects of the three probiotics on levels in different test periods

表1 不同試驗時期3種微生態(tài)制劑對養(yǎng)殖水體中含量的影響Tab.1 The effects of the three probiotics on levels in different test periods

注:同一種微生態(tài)制劑中，同列中標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P＜0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P ＞0.05)，下同。Note:In the same probitics，the means with the different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level，and the means with the same letters within the same column are not significant differences，et sequentia.

組別group ρ(NH +4 -N)/(mg·L -1)12 d 24 d 36 d 48 d 60 d對照 0.239 ±0.021a0.348 ±0.012a0.432 ±0.013a0.483 ±0.025a0.508 ±0.013 a A1 0.225 ±0.017a0.351 ±0.023a0.421 ±0.006a0.478 ±0.021a0.497 ±0.008a A2 0.218 ±0.014a0.334 ±0.011a0.405 ±0.014b0.435 ±0.007b0.463 ±0.013b A3 0.188 ±0.032b0.303 ±0.012b0.356 ±0.013c0.388 ±0.016c0.415 ±0.021c B1 0.217 ±0.014a0.319 ±0.007b0.381 ±0.015b0.427 ±0.007b0.458 ±0.007b B2 0.188 ±0.022b0.262 ±0.016c0.327 ±0.014c0.354 ±0.015c0.366 ±0.014c B3 0.173 ±0.038b0.233 ±0.022d0.284 ±0.009d0.322 ±0.016d0.343 ±0.008d C1 0.228 ±0.016a0.336 ±0.014a0.413 ±0.016a0.452 ±0.022b0.481 ±0.009b C2 0.204 ±0.031b0.296 ±0.009b0.369 ±0.005b0.407 ±0.017c0.447 ±0.024c C3 0.172 ±0.022c0.221 ±0.018c0.271 ±0.012c0.318 ±0.014d0.325 ±0.015 d

表2 不同試驗時期3種微生態(tài)制劑對養(yǎng)殖水體中含量的影響Tab.2 The effects of the three probiotics on levels in different test periods

表2 不同試驗時期3種微生態(tài)制劑對養(yǎng)殖水體中含量的影響Tab.2 The effects of the three probiotics on levels in different test periods

組別group ρ(NO -2 -N)/(mg·L -1)12 d 24 d 36 d 48 d 60 d對照 0.051 ±0.013a0.084 ±0.022a0.125 ±0.006a0.198 ±0.011a0.251 ±0.012 a A1 0.047 ±0.009a0.075 ±0.008a0.118 ±0.012a0.173 ±0.014b0.210 ±0.015b A2 0.041 ±0.005a0.068 ±0.013a0.106 ±0.021b0.169 ±0.009b0.196 ±0.007b A3 0.038 ±0.021b0.056 ±0.002b0.108 ±0.007c0.136 ±0.014c0.163 ±0.011c B1 0.040 ±0.012a0.071 ±0.005a0.113 ±0.015a0.187 ±0.013a0.198 ±0.023b B2 0.024 ±0.007b0.042 ±0.016b0.087 ±0.013b0.125 ±0.008b0.135 ±0.006c B3 0.019 ±0.014b0.030 ±0.022b0.078 ±0.002b0.110 ±0.006b0.128 ±0.014c C1 0.052 ±0.011a0.077 ±0.005a0.120 ±0.021a0.184 ±0.007a0.238 ±0.003a C2 0.048 ±0.009a0.073 ±0.013a0.106 ±0.008b0.151 ±0.017b0.176 ±0.011b C3 0.026 ±0.006b0.035 ±0.007b0.073 ±0.004c0.098 ±0.009c0.109 ±0.016 c

2.2 微生態(tài)制劑對幼參生長的影響

試驗期間各組的成活率均為100%，說明微生態(tài)制劑對幼參成活率沒有影響。從表3可見，各處理組的特定生長率均顯著高于對照組(P＜0.05)，3種微生態(tài)制劑對幼參生長的促進(jìn)作用隨濃度的增加而增強(qiáng)。其中，免疫增強(qiáng)劑作用最顯著，A1、A2、A3 組的特定生長率分別比對照組提高13.7%、19.4%和31.8%，B1、B2 組的特定生長率與B3 組有顯著性差異(P＜0.05)，C1、C2、C3 組間有顯著性差異(P＜0.05)。

2.3 微生態(tài)制劑對幼參免疫的影響

2.3.1 ACP 活力 從圖1可見，各處理組幼參體腔液中的ACP 活力均顯著高于對照組(P＜0.05);在試驗濃度范圍內(nèi)，幼參的ACP活力均隨微生態(tài)制劑濃度的增加而顯著升高，其中免疫增強(qiáng)劑作用最明顯，A1、A2、A3 組間均有顯著性差異(P＜0.05)，分別比對照組提高70.6%、130.1%和164.0%;而復(fù)合芽孢桿菌和EM 菌各組間差異則相對不明顯。

表3 不同種類和不同濃度的微生態(tài)制劑對幼參生長的影響Tab.3 The effects of the kinds and concentrations of the probiotics on growth in the sea cucumber

2.3.2 CAT 活力 從圖1可見:各處理組幼參體腔液中的CAT 活力均顯著高于對照組(P＜0.05);在試驗濃度范圍內(nèi)，幼參的CAT 活力均隨著微生態(tài)制劑濃度的增加而顯著升高，其中免疫增強(qiáng)劑的作用最明顯，A1、A2 組的CAT 活力與A3組間有顯著性差異(P＜0.05)，分別比對照組提高18.0%、28.4%和54.0%。

2.3.3 LSZ 活力 從圖1可見:除A1、B1、C1組外，其他處理組幼參體腔液中的LSZ 活力均顯著高于對照組(P＜0.05);在試驗濃度范圍內(nèi)，幼參的LSZ 活力均隨著微生態(tài)制劑濃度的增加而顯著升高，其中EM 菌作用最明顯，C1、C2、C3組間有顯著性差異(P＜0.05)，分別比對照組提高20.0%、60.7%和100.7%。

3 討論

由于養(yǎng)殖場試驗條件的限制，各試驗組只設(shè)置了兩個重復(fù)，相對于3 個重復(fù)的結(jié)果來說，會有一定的誤差。但本試驗結(jié)果基本上還是可以表明水質(zhì)和幼參各項指標(biāo)的變化趨勢。

圖1 3種微生態(tài)制劑對幼參體腔液中ACP、CAT、LSZ活力的影響Fig.1 The effect of the three probiotics on activities of acid phosphatase，catalase，and lysozyme in coelomic fluid of the sea cucumber

3.1 微生態(tài)制劑對幼參養(yǎng)殖水環(huán)境的影響

有研究表明，在水體中添加微生態(tài)制劑能在一定程度上改善水質(zhì)，其作用原理是利用益生菌排斥水體中的致病菌和有害菌，通過分泌抑菌物質(zhì)，競爭生態(tài)位來抑制致病菌的增長，同時還能直接影響水中氮循環(huán)細(xì)菌數(shù)量而促進(jìn)水體的氮循環(huán)，達(dá)到降低水體含量的目的［12-13］。在養(yǎng)殖過程中，殘餌、糞便是污染的主要來源，N 含量升高，引起水質(zhì)惡化，同時也為某些條件性致病菌提供了營養(yǎng)，增加了刺參致病的危險。水體中加入微生態(tài)制劑后，通過氨化、氧化、硝化等作用，降解有機(jī)廢物，減小其危害性，使水體環(huán)境穩(wěn)定［14-15］。

3.2 微生態(tài)制劑對幼參生長的影響

微生態(tài)制劑本身含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，同時隨著它們在動物消化道內(nèi)的定植、繁衍和代謝，可產(chǎn)生動物生長所需的維生素、氨基酸、促生長因子以及蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維酶等多種酶，從而增強(qiáng)養(yǎng)殖對象的營養(yǎng)代謝，增加機(jī)體對養(yǎng)分的消化利用，促進(jìn)其生長。另一方面，微生態(tài)制劑還可通過競爭抑制以及產(chǎn)生抑菌物質(zhì)等方式抑制有害細(xì)菌，從而起到預(yù)防病害的作用。試驗表明，微生態(tài)制劑對刺參生長有一定的促進(jìn)作用。如袁成玉等［18］發(fā)現(xiàn)，使用光合細(xì)菌和芽孢桿菌投喂幼參能明顯促進(jìn)幼參生長;周慧慧等［19］采用分離自刺參腸道的益生菌投喂稚參，顯著提高了稚參的成活率和生長率。

本試驗結(jié)果表明，各處理組生長率顯著高于對照組，說明3種微生態(tài)制劑可在一定程度上促進(jìn)幼參生長。不同濃度之間，試驗范圍內(nèi)濃度越大對幼參生長的促進(jìn)作用越顯著。這可能與投喂?jié)舛雀?，有益菌可以更快進(jìn)入和定植幼參腸道，提高幼參消化吸收率有關(guān)。不同微生態(tài)制劑之間，以免疫增強(qiáng)劑的促生長效果最顯著，可能與其含有免疫肽和乳桿菌，快速改善刺參消化代謝有關(guān)。對于刺參消化道內(nèi)益生菌的定植規(guī)律和作用周期尚需進(jìn)一步探討。

3.3 微生態(tài)制劑對幼參免疫的影響

刺參通過體腔液中具有吞噬能力的細(xì)胞對侵入的外來物質(zhì)進(jìn)行吞噬清除，借助細(xì)胞內(nèi)的溶酶體酶，如酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、過氧化氫酶等對異物進(jìn)行裂解和消化，以達(dá)到免疫保護(hù)的效果。ACP是巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶和巨噬細(xì)胞內(nèi)最有代表性的水解酶之一。CAT是一種含F(xiàn)e(Ⅲ)-原卟啉的氧化還原酶，主要用于快速催化分解代謝中產(chǎn)生的過氧化氫，對生長發(fā)育和代謝活動具有重要意義。LSZ是一種堿性蛋白，通過水解細(xì)菌細(xì)胞壁中的乙酰氨基多糖，破壞和消除侵入體內(nèi)的異物。陳文典等［20］使用枯草芽孢桿菌膠囊投喂中華絨螯蟹，可以明顯提高其LSZ和ACP 活力。徐琴等［21］研究表明，微生態(tài)制劑是良好的非特異性免疫增強(qiáng)劑，能有效地增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，提高抗逆能力，使中國對蝦表現(xiàn)出最佳的生長狀態(tài)。本試驗中，各處理組幼參體腔液中的ACP、CAT、LSZ 活力均顯著高于對照組，表明添加微生態(tài)制劑可以有效地提高幼參的免疫力。其中免疫增強(qiáng)劑對ACP和CAT 活力的增強(qiáng)作用最顯著，EM 菌對LSZ 活力的增強(qiáng)作用最明顯，隨著制劑用量的增加作用效果顯著。益生菌的種類和用量是微生態(tài)制劑作用的關(guān)鍵因子，生產(chǎn)上應(yīng)根據(jù)不同用途選擇含有所需益生菌的微生態(tài)制劑，亦可嘗試添加混合益生菌劑，以達(dá)到改善水環(huán)境、防病和促生長的效果。

［1］Kozasa M.Toyocerin(Bacillus toyoi)as growth promotor for animal feeding［J］.Microbiologie Aliments Nutrition，1986，4(1):121 -135.

［2］張濤，白嵐，李蕾，等.不同添加量的益生菌組合對仿刺參消化和免疫指標(biāo)的影響［J］.大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報，2009(S1)，24:64-68.

［3］Zhang Q，Ma H M，Mai K S，et al.Interaction of dietary Bacillus subtilis and fructooligosaccharide on the growth performance，nonspecific immunity of sea cucumber，Apostichopus japonicus［J］.Fish＆ Shellfish Immunology，2010，29(2):204 -211.

［4］付鑫，吳垠，蘇顯屹，等.添加微生態(tài)制劑及投飼模式對幼刺參生長的影響［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2011，30(12):739 -743.

［5］Zhao Y C，Zhang W B，Xu W，et al.Effects of potential probiotic Bacillus subtilis T13 on growth，immunity and disease resistance against Vibrio splendidus infection in juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus［J］.Fish ＆Shellfish Immunology，2012，32(5):750 -755.

［6］Zhao Y C，Mai K S，Xu W，et al.Influence of dietary probiotic Bacillus TC22 and probiotic fructooligosaccharide on growth，immune responses and disease resistance against Vibrio splendidus infection in sea cucumber Apostichopus japonicus［J］.Journal of Ocean University of China，2011，10(3):293 -300.

［7］王吉橋，王志香，張凱，等.飼料中添加蛋氨酸硒對仿刺參幼參存活、生長及免疫指標(biāo)的影響［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報，2012，27(2):110 -115.

［8］吳亞楠，柳鵬，李強(qiáng)，等.復(fù)方中草藥對仿刺參免疫力和抗病力的影響［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報，2011，26(2):338 -343.

［9］王吉橋，王志香，于紅艷，等.飼料中不同類型的硒對仿刺參幼參生長和免疫指標(biāo)的影響［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報，2011，26(2):306 -311.

［10］王亞敏，王印庚.微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的作用機(jī)理及應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29(6):72 -75.

［11］陳佳榮.水化學(xué)實驗指導(dǎo)書［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1998:158 -159.

［12］吳保承，沈國強(qiáng)，楊春霞，等.微生態(tài)制劑在水質(zhì)凈化中的應(yīng)用現(xiàn)狀及展望［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2010，33(12):408 -410.

［13］王篤彩，閆斌倫，李士虎，等.3種微生態(tài)制劑對養(yǎng)殖水體水質(zhì)影響的比較研究［J］.水生態(tài)學(xué)雜志，2011，32(1):66 -70.

［14］朱學(xué)芝，鄭石軒，潘慶軍，等.微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦生長及水質(zhì)的影響［J］.中山大學(xué)學(xué)報，2008，47:58 -62.

［15］劉鐵鋼，趙文，劉鋼，等.5種微生態(tài)制劑對刺參幼參的生態(tài)安全性［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報，2012，27(2):129 -136.

［16］徐琴，李健，劉淇，等.4種微生態(tài)制劑對對蝦育苗水體主要水質(zhì)指標(biāo)的影響［J］.海洋科學(xué)，2009，33(3):10 -15.

［17］王路平，吳垠，班紅琴，等.微生態(tài)制劑對刺參幼參在封閉式循環(huán)系統(tǒng)中的應(yīng)用研究［J］.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2009，21(6):497 -499.

［18］袁成玉，張洪，吳垠，等.微生態(tài)制劑對幼刺參生長及消化酶活性的影響［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2006，25(12):612 -615.

［19］周慧慧，馬洪明，張文兵，等.仿刺參腸道潛在益生菌對稚參生長、免疫及抗病力的影響［J］.水產(chǎn)學(xué)報，2010，34(6):955 -963.

［20］陳文典，李義，郝向舉，等.枯草芽孢桿菌微膠囊制劑對中華絨螯蟹免疫機(jī)能及抗病力的影響［J］.中國飼料，2009(5):33-36.

［21］徐琴，李健，劉淇，等.噬菌蛭弧菌和粘紅酵母對中國對蝦生長及非特異免疫因子的影響［J］.海洋水產(chǎn)研究，2007，28(5):42 -47.