劉明泰，李楊，劉小林，許淑芬，常亞青

(1.大連海寶漁業(yè)有限公司，遼寧 大連116045;2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌712100;3.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連116023)

皺紋盤鮑Haliotis discus hannai是中國北方地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)貝類［1］，隨著工廠化養(yǎng)殖的發(fā)展，迫切需要對其開展分子育種的相關(guān)研究工作。目前常用的分子標(biāo)記主要有隨機(jī)擴(kuò)增片段多態(tài)性(RAPD)、微衛(wèi)星、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、擴(kuò)增性片段多態(tài)性(AFLP)等。其中微衛(wèi)星標(biāo)記應(yīng)用最為廣泛，但其特異性引物開發(fā)成本較高，SNP 分析需要進(jìn)行大量測序，RAPD 技術(shù)重復(fù)性較差，而AFLP 技術(shù)則操作繁瑣［2］。上述各種標(biāo)記各有優(yōu)劣，而一種理想的標(biāo)記要求不僅成本低廉、易于操作，而且重復(fù)性好，相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence - Related Amplified Polymorphism，SRAP)便是這樣一種標(biāo)記。SRAP是基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)的一種分子標(biāo)記，它通過獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)優(yōu)先擴(kuò)增基因組內(nèi)的開放閱讀框(ORFs)，因?yàn)殚_放閱讀框是可以編碼完整的多肽鏈結(jié)構(gòu)基因，SRAP 標(biāo)記的正、反引物分別與外顯子和內(nèi)含子(或啟動子)區(qū)域配對，在不同個(gè)體間因外顯子和內(nèi)含子間隔長度不同而產(chǎn)生多態(tài)［3］。SRAP 技術(shù)已經(jīng)大量應(yīng)用于植物的遺傳多樣性分析和遺傳圖譜的構(gòu)建［4-8］，在水產(chǎn)動物中，此技術(shù)主要應(yīng)用于日本沼蝦［9］、草魚［10］、三疣梭子蟹［11］、黃顙魚［12］和團(tuán)頭魴［13］的遺傳學(xué)研究中，在貝類中目前尚未見相關(guān)報(bào)道。有研究認(rèn)為，PCR 反應(yīng)條件是影響SRAP 標(biāo)記擴(kuò)增效率的重要因素［2］。本研究中，作者利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法探討了SRAP 標(biāo)記在皺紋盤鮑群體中的最佳反應(yīng)條件，以期為SRAP 標(biāo)記應(yīng)用于皺紋盤鮑的種質(zhì)資源評估和遺傳育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用皺紋盤鮑194 頭(體質(zhì)量為69.3 ±8.3 g)，于2011年4月取自大連太平洋海珍品有限公司第一育苗場，外套膜組織樣本保存于體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇中以備提取基因組DNA。

試驗(yàn)用主要試劑Taq DNA 聚合酶(簡稱為Taq酶)、dNTPs和100 bp DNA Ladder等購自Tiangen生化科技(北京)有限公司，核酸染料Gelred 購自上海開放生物科技有限公司。SRAP 引物由南京金斯瑞公司合成，SRAP 引物序列設(shè)計(jì)如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 的提取 皺紋盤鮑基因組DNA的提取參照Strauss［14］的方法進(jìn)行，采用10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。

表1 SRAP 引物序列Tab.1 The sequences of SRAP primers

1.2.2 SRAP - PCR 反應(yīng)程序 隨機(jī)選用引物me1/em3 進(jìn)行優(yōu)化，采用10 μL 反應(yīng)體系，按照Li等［3］的方法，以皺紋盤鮑基因組DNA 為模板的SRAP-PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃下預(yù)變性5 min;94 ℃下變性1 min，35 ℃下退火1 min，72 ℃下延伸1 min，共進(jìn)行5 個(gè)循環(huán);94 ℃下變性1 min，50 ℃下退火1 min，72 ℃下延伸1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán);最后在72 ℃下再延伸10 min。PCR 產(chǎn)物首先用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后使用8 g/L 的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分型。

1.2.3 反應(yīng)體系因素水平的確定及正交設(shè)計(jì) 影響PCR 擴(kuò)增效果的因素主要有Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度、模板DNA 以及Taq 酶活性。根據(jù)徐宗大等［15］的設(shè)計(jì)方案，本研究中采用L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對以上5 個(gè)因素進(jìn)行4 水平篩選，共16 個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)，各因素水平見表2。根據(jù)電泳條帶的多少、清晰度及背景顏色進(jìn)行打分。條帶最豐富、清晰度最高、背景顏色最淺的記為16 分，反之則扣分，最差得1 分，計(jì)算每個(gè)因素在不同水平下的得分總和及其均值k，以及各因素的極差R。

表2 SRAP-PCR 體系的因素水平Tab.2 Factors and levels of SRAP-PCR reaction system

1.2.4 體系穩(wěn)定性檢測 隨機(jī)選用5 對引物組合(me1/em2，me2/em1，me3/em5，me4/em4，me5/em3)對反應(yīng)體系的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測，每對引物設(shè)置2次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳結(jié)果評分和極差分析

根據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)，對3次重復(fù)試驗(yàn)所得的電泳圖譜(圖1，僅顯示1次電泳結(jié)果)分別統(tǒng)計(jì)，得分見表3。從3次電泳的得分來看，各重復(fù)差異不大，試驗(yàn)的一致性較好。其中以1 號和10 號試驗(yàn)組效果最好，評分分別達(dá)到15.67和14.67 分，以12 號試驗(yàn)組效果最差，評分僅為2.33 分，這與圖1 顯示的結(jié)果一致。各因素的極差值大小反映了其對反應(yīng)結(jié)果整體的影響程度，由表3 的極差分析可見，模板量對反應(yīng)結(jié)果影響最大，Taq 酶活性影響最小，各因素對PCR 擴(kuò)增結(jié)果的影響從大到小依次為模板DNA ＞Mg2+濃度＞dNTPs 濃度＞引物濃度＞Taq 酶活性。

圖1 SRAP-PCR 反應(yīng)產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of SRAP-PCR products

2.2 各因素水平對PCR 反應(yīng)結(jié)果的影響

Mg2+是影響PCR 反應(yīng)結(jié)果最重要的因素之一。較高的Mg2+濃度能夠提高Taq 酶的活性，提高PCR 的產(chǎn)率，但是Mg2+濃度過高又容易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，反映在電泳結(jié)果上就是影子帶增多，背景變深，降低了結(jié)果的可讀性和可重復(fù)性。從圖2可見:Mg2+濃度為1.5 mmol/L 時(shí)，實(shí)現(xiàn)最佳擴(kuò)增;Mg2+濃度為2.0 mmol/L 時(shí)，擴(kuò)增效果反而下降，可讀性變差;Mg2+濃度為2.5 ～3.0 mmol/L時(shí)，隨著離子濃度的增加擴(kuò)增效果再次開始好轉(zhuǎn)，但最終沒有超過1.5 mmol/L 濃度時(shí)的擴(kuò)增效果。故最佳的Mg2+反應(yīng)濃度為1.5 mmol/L。

表3 SRAP-PCR 反應(yīng)因素水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Design and results of orthogonal test for SRAP-PCR reaction

dNTPs是PCR 反應(yīng)的底物。底物濃度過低，直接影響PCR 反應(yīng)的合成效率，濃度過高則會導(dǎo)致聚合酶將錯(cuò)誤堿基滲入。從圖2可見:當(dāng)dNTPs濃度為0.15 ～0.25 mmol/L 時(shí)，隨著dNTPs 濃度的升高，評分值反而降低，這主要是由于非特異性擴(kuò)增增加，導(dǎo)致背景變深，可讀性變差;當(dāng)dNTPs濃度為0.3 mmol/L 時(shí)，評分值略有上升，但仍低于0.15 mmol/L 濃度時(shí)的評分值。故最優(yōu)的dNTPs反應(yīng)濃度為0.15 mmol/L。

Taq 酶是PCR 反應(yīng)的核心，酶量過多會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，過少則可能導(dǎo)致條帶不清晰甚至完全沒有條帶。從圖3可見:酶活性為0.25 ～0.50 U時(shí)，評分值有所下降;酶活性為0.50 ～0.75 U 時(shí)，評分值開始回升;酶活性超過0.75 U 時(shí)，評分值又開始下降。故最佳Taq 酶活性水平為0.25 U。

圖2 Mg2+、dNTPs 濃度與評分均值的關(guān)系Fig.2 Relationship between concentrations and mean scores of Mg2+and dNTPs factor

引物濃度過高，可能會產(chǎn)生錯(cuò)配或二聚體，體現(xiàn)在電泳結(jié)果上就是小片段增多，重復(fù)性變差;濃度過低則可能造成PCR 產(chǎn)量不足，條帶不清晰。從圖3可見:引物濃度為0.1 ～0.2 μmol/L 時(shí)，評分值提高，這主要是因?yàn)闂l帶變清晰;引物濃度為0.2 ～0.4 μmol/L 時(shí)，評分值呈降低趨勢，主要是因?yàn)橛白訋Ш投垠w增多。故最佳引物反應(yīng)濃度為0.2 μmol/L。

模板DNA 水平過低，會導(dǎo)致PCR 擴(kuò)增結(jié)果不穩(wěn)定;過高則可能造成條帶冗余，給識別帶來困難。從圖3可見:模板DNA 為20 ng 時(shí)反應(yīng)體系獲得了最高分，此時(shí)條帶最清晰;模板DNA 為20 ～60 ng 時(shí)，評分值逐漸降低，背景增強(qiáng);模板DNA 為60 ～80 ng 時(shí)，評分值又有所上升，因?yàn)槟０錎NA 的增加造成PCR 產(chǎn)物增加，擴(kuò)增條帶再次變清晰。故最佳模板DNA 反應(yīng)水平為20 ng。

圖3 Taq 酶活性、引物濃度和模板DNA 量與評分均值的關(guān)系Fig.3 Relationship between the activities and mean scores of Taq polymerase，primer，and template DNA factor

2.3 最優(yōu)因子組合的篩選和驗(yàn)證

從表3 的極差分析表明，最優(yōu)試驗(yàn)組合為A1B1C1D2E1，即10 μL反應(yīng)體系中，Mg2+1.5 mmol/L、dNTPs 0.15 mmol/L、引物0.2 μmol/L、Taq 酶活性0.25 U 以及模板DNA 20 ng 時(shí)，PCR擴(kuò)增結(jié)果最佳。在此條件下，對最佳試驗(yàn)組合進(jìn)行驗(yàn)證，電泳結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，相對于優(yōu)化前的反應(yīng)體系(圖1)，新體系擴(kuò)增效率更穩(wěn)定，可讀條帶更多，可以認(rèn)為優(yōu)化反應(yīng)體系起到了預(yù)期的效果。

圖4 體系優(yōu)化后SRAP-PCR 反應(yīng)產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoresis of SRAP - PCR products after optimization

3 討論

良好的可讀性和可重復(fù)性，是分子標(biāo)記應(yīng)用于遺傳學(xué)研究的重要前提。一般來說，對于二倍體生物，一次只掃描一個(gè)位點(diǎn)的微衛(wèi)星標(biāo)記和SNP 標(biāo)記更易被準(zhǔn)確識別。而一次擴(kuò)增產(chǎn)生大量片段的RAPD、AFLP等標(biāo)記均存在著影子帶多、識別困難、可重復(fù)性較差等問題。這就要求在應(yīng)用這些分子標(biāo)記之前花費(fèi)一定的精力去優(yōu)化其反應(yīng)條件。作為一種高效和新穎的分子標(biāo)記，SRAP 從誕生伊始就受到了遺傳學(xué)家的喜愛，廉價(jià)、高效和簡單的操作特點(diǎn)，迅速在植物育種中普及開來。相對于AFLP，SRAP 擴(kuò)增的條帶數(shù)較少，識別相對簡單;相對于RAPD，SRAP 的擴(kuò)增穩(wěn)定性大大提高，假陽性率相對較低;相對于微衛(wèi)星和SNP，SRAP 不需要預(yù)先知道基因組序列，成本低廉［2］。這些都說明SRAP 標(biāo)記在種群動態(tài)、種質(zhì)資源評估和育種中都將有更為廣泛地應(yīng)用。在水產(chǎn)動物上SRAP 技術(shù)的應(yīng)用剛剛起步，在貝類中則尚未見報(bào)道。從目前的研究看來，對于不同物種SRAP 的反應(yīng)體系往往有較大的差異［16-17］，在應(yīng)用到新物種上時(shí)需要進(jìn)行反應(yīng)體系的優(yōu)化。從本研究結(jié)果來看，優(yōu)化反應(yīng)體系確實(shí)提高了擴(kuò)增條帶的識別率，降低了假陽性和誤判發(fā)生的概率。

作為一種基于PCR 技術(shù)的分子標(biāo)記，優(yōu)化SRAP 反應(yīng)體系實(shí)際上就是優(yōu)化PCR 反應(yīng)體系，其影響因素自然也就是影響PCR 擴(kuò)增效率的幾大因素——Mg2+濃度、dNTPs 濃度、引物濃度、模板DNA 以及Taq 酶活性。優(yōu)化方法一般有3種:單因素試驗(yàn)、均勻試驗(yàn)和正交試驗(yàn)。相對其他兩種試驗(yàn)，正交試驗(yàn)不僅試驗(yàn)次數(shù)較少而且能夠顧及各因素間的交互作用，是相對較佳的一種方法。目前，大多數(shù)物種的SRAP 反應(yīng)體系優(yōu)化都是采用正交試驗(yàn)［16，18-19］，少數(shù)采用單因素試驗(yàn)［8］，本研究中也采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化了SRAP 反應(yīng)體系，用較少的試驗(yàn)取得了良好的結(jié)果。

在皺紋盤鮑SRAP 反應(yīng)體系優(yōu)化涉及到的5 個(gè)因素中，模板DNA和Mg2+濃度對反應(yīng)結(jié)果影響最大，Taq 酶活性的影響最小，該結(jié)果與對三疣梭子蟹的研究結(jié)果相類似［11］，與對大多數(shù)植物的研究結(jié)果不同［5，15-17］，這可能是由于海產(chǎn)動物的細(xì)胞組織含鹽量高以及對動植物DNA 提取方法不同所致。該SRAP-PCR 反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化為今后利用這種標(biāo)記在皺紋盤鮑種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析和標(biāo)記輔助選擇等方面提供了較先進(jìn)的技術(shù)方法，也必將加快分子標(biāo)記輔助選擇在皺紋盤鮑育種中的應(yīng)用。

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