郭曉黎，仇雪梅，常亞青，張偉杰，崔軍，叢玉婷，吳領(lǐng)知，劉洋，王秀利

(1.大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連116023;2.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連116023)

海膽的可食用部分為生殖腺，其生殖腺有著生殖和儲存營養(yǎng)的雙重作用［1］。海膽的生殖腺含有大量蛋白質(zhì)、氨基酸、高度不飽和脂肪酸、糖類等具有特殊生理活性的物質(zhì)，特別是含有防治心血管疾病的有效藥物成分，具有較高的營養(yǎng)和藥用價值［2］。蝦夷馬糞海膽Strongylocentrotus intermedius原產(chǎn)于日本北海道和俄羅斯遠東沿海，由于其生殖腺色澤好、味甜，在國際市場廣受歡迎。大連海洋大學(xué)于1989年將蝦夷馬糞海膽從日本引入中國，目前已成為中國北方沿海特別是遼東和山東半島養(yǎng)殖的重要海珍品［3］。

CYP17是細胞色素P450 家族的重要成員之一。CYP17 基因編碼的細胞色素P45017α 羥化酶/17，20 裂解酶(17α - hydroxylase/17，20 - lyase)是類固醇激素合成的關(guān)鍵酶之一，該基因的表達水平可在一定程度上決定動物體內(nèi)性激素的水平［4］。CYP17是合成雄激素的關(guān)鍵類固醇激素生成酶，同時對雌激素合成也是必不可少的(由雄激素芳香化而來)，在生殖內(nèi)分泌中發(fā)揮重要作用［4-6］。CYP17 具有兩種酶活性，即17α-羥化酶和17，20-裂解酶活性，前者可以催化孕酮或黃體酮轉(zhuǎn)化成17α-羥基孕酮，后者繼續(xù)催化17α -羥基孕酮轉(zhuǎn)化成雄烯二酮。雄烯二酮再經(jīng)過17β -HSD(17β-羥類固醇激素脫氫酶)生成睪酮，然后再在P450 芳香化酶(CYP19)作用下轉(zhuǎn)化為17β - 雌二醇。而雌二醇是類固醇激素，參與繁殖過程的調(diào)控，包括性別分化、性成熟和其他方面，因此，體內(nèi)雌二醇在空間和時間上的平衡對機體執(zhí)行正確的機能非常重要［7-8］，對性腺的生長和發(fā)育起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。本研究中，作者首次克隆了蝦夷馬糞海膽CYP17 基因的cDNA 序列，并對該基因在不同家系雌、雄個體以及同一家系不同生殖腺發(fā)育階段的表達進行了分析，旨在為今后利用該基因輔助育種培育蝦夷馬糞海膽優(yōu)良品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 蝦夷馬糞海膽取自大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室。于2010年7月分別選取相同日齡的6 -2、10 -3、1 -3 家系蝦夷馬糞海膽(均為2008年10月培育)，于2010年8月4日、9月20日、10月25日選取日齡分別為430、477、512 d 的4 -1 家系蝦夷馬糞海膽(2009年5月底培育)，每次每個家系采樣10 ～16 個，以保證每次每個家系有3 個雌海膽和3 個雄海膽。

1.1.2 主要試劑、藥品 引物由寶生物工程(大連)有限公司合成;Taq DNA 聚合酶、dNTPs、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA 酶抑制劑、PMDT -19 載體、DNA 切膠回收試劑盒、Real - time RT - PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Primix Ex TaqTMⅡ試劑盒、EASY Dilution、RNase free H2O等購自寶生物工程(大連)有限公司;Trizol 試劑盒購自美國Invitrogen 公司;其他常規(guī)試劑均取自大連海洋大學(xué)基因工程實驗室。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 活體解剖取出海膽性腺組織，迅速放入液氮中凍存，然后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?同時取相同部位的生殖腺用Bouin's 液固定24 h 后，用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精保存，用于組織切片的制備。

1.2.2 海膽性別的鑒定 采用組織切片技術(shù)，按照文獻［9］中的方法對海膽的性別及生殖腺發(fā)育時期進行鑒定。

1.2.3 總RNA 的提取和cDNA 第一鏈的合成 提取3 個不同家系(6 -2 家系、10 -3 家系、1 -3家系)和同一家系(4 -1 家系)3 個不同發(fā)育時間段蝦夷馬糞海膽的總RNA，按照Trizol 總RNA提取試劑盒說明書方法進行總RNA 的提取?？俁NA 質(zhì)量檢測合格后，用M -MLV 反轉(zhuǎn)錄酶按照試劑盒說明書方法合成cDNA 第一鏈。

1.2.4 蝦夷馬糞海膽CYP17 基因克隆的引物設(shè)計蝦夷馬糞海膽CYP17 基因cDNA 的引物設(shè)計、克隆及生物信息學(xué)分析參照文獻［10］中的方法。

糜蛋白酶（Chymotrypsin）是從牛胰臟提取出來的一種白色或類白色粉末，能溶于水，其水溶液的pH為5.5～6.5，在pH3～5時最穩(wěn)定，pH為7時活性最強，等電點為pH8.3。

1.2.5 蝦夷馬糞海膽CYP17 基因表達的引物設(shè)計和篩選 根據(jù)上述已克隆的蝦夷馬糞海膽CYP17基因的 cDNA 序列(GenBank 注冊號為HM854853)設(shè)計表達分析的引物，內(nèi)參基因18S rRNA引物參照文獻［11］設(shè)計，引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR 引物設(shè)計Tab.1 Primers used for Real Time Quantitative PCR

1.2.6 反轉(zhuǎn)錄 使用PrimeScriptTMreagent kit 試劑盒進行海膽cDNA 第一鏈的合成，反應(yīng)步驟按試劑盒說明書方法進行。

1.2.7 實時熒光定量PCR 實時熒光定量檢測采用SYBR Green I 嵌合熒光法，選擇相對定量中的△△CT比較法分析CYP17 基因的表達水平。

1)實時定量PCR 體系及反應(yīng)條件。實時定量PCR 總體系為20 μL，其中包括10 μL SYBR Realtime PCR Master Mix、0.8 μL上游引物(10 μmol/L)、0.8 μL下游引物(10 μmol/L)、0.4 μL ROX Reference Dye(50 ×)、2 μL 模板cDNA和6 μL 無RNase 酶水。反應(yīng)條件為:95 ℃下預(yù)變性10 s;95 ℃下預(yù)變性5 s，60 ℃下退火和延伸34 s，共進行40 個循環(huán);最后在95 ℃下變性1 min，60 ℃下退火30 s，95 ℃下延伸30 s，形成溶解曲線。

2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。采用相對定量比較CT法，根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果選擇表達量較高(高拷貝數(shù))且均一穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)品，分別建立內(nèi)參基因和目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)品初始濃度為25 ng/μL，進行倍比稀釋，設(shè)置6 個稀釋濃度，每個濃度設(shè)2 個重復(fù)。

3)模板的稀釋。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，最佳模板濃度為12.5 ng/μL。以蝦夷馬糞海膽總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 濃度為25 ng/μL，所有待測樣品用EASY Dilution 稀釋4 倍后備用。

4)實時定量PCR。使用Agilent Mx3000P 熒光定量PCR 儀，根據(jù)SYBR Primix Ex TaqTMⅡ試劑盒配制混合試劑，按照軟件程序設(shè)定反應(yīng)條件進行定量PCR。對每個樣品均進行CYP17 基因(目的基因)和18S rRNA 基因(內(nèi)參基因)的RT - PCR反應(yīng)，同時進行3 個陰性對照的RT - PCR 反應(yīng)，每個處理均重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實時定量數(shù)據(jù)分析采用2-△△CT法，計算方法如下:

CYP17 基因表達的相對濃度

式中:Ct 為熒光信號達到設(shè)定的域值時的循環(huán)數(shù);CtA、CtB分別為目的基因和內(nèi)參基因的Ct 值;ExA、ExB分別為目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率。其中:

1)每個個體計算△CT=CtA-CtB;

2)計算雌性、雄性組海膽的△CT均值，選擇△CT均值最高的一組，作為參照組;

3)每個個體計算△△CT=△CT(個體)-△CT(參照組);

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦夷馬糞海膽的雌、雄鑒定結(jié)果

采用石臘組織切片技術(shù)，對相同日齡的6 -2、10 -3、1 -3 家系蝦夷馬糞海膽進行性別鑒定，結(jié)果表明，3 個家系的生殖腺均處于成熟前期。對3個不同日齡的4 -1 家系蝦夷馬糞海膽進行性別鑒定，結(jié)果表明，430、477、512日齡4 -1 家系海膽的生殖腺分別處于生長期、成熟前期和成熟期。4 -1 家系蝦夷馬糞海膽生殖腺發(fā)育的組織切片如圖1所示。

圖1 3 個不同日齡的4 -1 家系蝦夷馬糞海膽的生殖腺分期Fig.1 Representative morphology of the gonad in three different day sea urchin Strongylocentrotus intermedius family 4 -1

2.2 蝦夷馬糞海膽CYP17 基因的克隆與分析

2.2.1 蝦夷馬糞海膽CYP17 基因的序列分析 經(jīng)克隆和生物信息學(xué)分析，得到了一條1 570 bp 的cDNA 序列，并遞交到GenBank 數(shù)據(jù)庫中(Gen-Bank 注冊號為HM854853)。該基因的ORF(開放閱讀框)自起始密碼子ATG 至終止密碼子TAA 全長為1 482 bp。該基因編碼493 個氨基酸的蛋白質(zhì)，其相對分子質(zhì)量約為55 540，等電點為8.068。

2.2.2 蝦夷馬糞海膽CYP17 基因的同源性與進化樹分析 使用Mega 4.0 軟件將蝦夷馬糞海膽與其他18 個物種的CYP17 基因的氨基酸序列進行同源性比較。結(jié)果表明:與紫球海膽S.purpuratus 的同源性為97%，與光棘球海膽S.nudus 的同源性為96%，與囊舌蟲Saccoglossus kowalevskii 的同源性為47%，與青鳉Oryzias latipes和斑點叉尾鮰Ictalurus punctatus 的同源性均為37%，與鰻魚Anguilla japonica、斑馬魚Danio rerio、紅鰭東方鲀Takifugu rubripes和雞Gallus gallus 的同源性均為36%，與蟾蜍Glandirana rugosa和斑胸草雀Taeniopygia guttata的同源性均為35%，與非洲爪蛙Xenopus tropicalis的同源性為34%，與安樂蜥Anolis carolinensis和響尾蛇Crotalus adamanteus 的同源性均為33%，與人Homo sapiens和牛Bos taurus 的同源性均為29%，與豬Sus scrofa和家鼠Mus musculus 的同源性均為28%。

通過對圖2 的進化樹分析可看出，3種海膽的氨基酸序列具有高度同源性，這說明海膽作為棘皮動物在CYP17 基因的氨基酸序列上具有種屬特異性，且在進化過程中具有高度保守性。

圖2 不同物種CYP17 氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of CYP17 based on amino acid sequences in different species

2.3 蝦夷馬糞海膽CYP17 基因的表達差異

2.3.1 CYP17 基因在蝦夷馬糞海膽不同家系間的差異表達 本試驗中隨機選擇3 個家系的蝦夷馬糞海膽，研究CYP17 基因在不同家系間同一生殖腺發(fā)育時期的雌、雄差異表達。從圖3可見:3 個不同家系的蝦夷馬糞海膽CYP17 基因在雌、雄生殖腺成熟前期存在顯著的差異表達;在雄性個體中，CYP17 基因在1 -3 家系的表達量最高，在6-2 家系的表達量最低;盡管CYP17 基因在雌性個體中的表達量相對較低，但與該基因在雄性個體中的表達量也有相對的比例。其中6 -2、10 -3、1-3 家系雄性海膽CYP17 基因的表達量與雌性海膽該基因的表達量比例約為158∶ 1、88∶ 1、218∶ 1。為準(zhǔn)確了解雌性海膽CYP17 基因在不同家系間的差異表達，將圖3 中雌性海膽該基因的表達水平放大，如圖4所示。從圖4可見:CYP17 基因在6 -2 家系的表達量最低;在10 -3 家系的表達量最高，約為6 -2 家系的3.85 倍;在1 -3 家系的表達量次之，約為6 -2 家系表達量的2.37 倍。

2.3.2 CYP17 基因在蝦夷馬糞海膽同一家系不同生殖腺發(fā)育時期的差異表達 CYP17 基因在蝦夷馬糞海膽4 -1 家系3 個不同發(fā)育時期雌、雄生殖腺表達結(jié)果如圖5所示。3 個不同發(fā)育時間段中，CYP17 基因在雄性海膽生殖腺中的表達量均明顯高于其在雌性海膽生殖腺中的表達水平，其中430、477、512日齡雄性海膽的表達量與雌性海膽表達量比例約為25∶ 1、33∶ 1、5∶ 1。CYP17 基因在雄性海膽性腺中的表達量隨著日齡的增加而增加;而雌海膽性腺在發(fā)育第430天到第447天表達量略有增加，發(fā)育到第512天表達量明顯增加。

圖3 3 個不同家系蝦夷馬糞海膽雌、雄性腺CYP17 基因相對定量(以18S rRNA 為參照)Fig.3 Comparative quantities of CYP17 gene expressions in the ovary of three family strains of sea urchin S.intermedius

圖4 3 個不同家系雌性蝦夷馬糞海膽CYP17 基因相對定量Fig.4 Comparative quantities of CYP17 gene expressions in the ovary of three family strains of sea urchin S.intermedius

圖5 4 -1 家系蝦夷馬糞海膽不同發(fā)育時間段雌、雄性腺CYP17 基因相對定量(以18S rRNA 為參照)Fig.5 Comparative quantities of CYP17 gene expressions in the ovary of family 4 - 1 sea urchin S.intermedius in different development time

3 討論

近年來，一些學(xué)者對海膽體腔液提取物、多糖等的分離和純化、精子的超低溫保存、生長代謝等方面進行了基礎(chǔ)和應(yīng)用研究［3，12-16］。由于海膽的可食用部分主要是生殖腺，因此，如何提高海膽生殖腺的產(chǎn)量和質(zhì)量是海膽育種學(xué)家和廣大生產(chǎn)者需要解決的重大課題。CYP17是性激素合成的關(guān)鍵酶，對動物性別決定、性別分化和生殖腺發(fā)育起著重要作用。所以，本研究中選擇CYP17 基因作為蝦夷馬糞海膽生殖腺生長和發(fā)育的主要候選基因。

海膽的性別在外觀或外形上難以鑒別，即使解剖觀察生殖腺，在生殖腺成熟以前也難以鑒別雌、雄，需要通過組織切片技術(shù)鑒別雌、雄并進行生殖腺發(fā)育分期。本研究中通過組織切片技術(shù)進行海膽的性別鑒定和生殖腺發(fā)育時期的判別，得到了準(zhǔn)確的結(jié)果。

本研究中首次克隆了蝦夷馬糞海膽CYP17 基因的cDNA 序列，其編碼的氨基酸序列與紫球海膽和光棘球海膽的該氨基酸序列有高度的同源性，分別為97%和96%。高度的同源性反映了同類物種在進化上的高度相似性。

本研究中發(fā)現(xiàn)，蝦夷馬糞海膽CYP17 基因在3個不同家系和同一家系3 個不同發(fā)育時間段的雌、雄海膽生殖腺中均有表達，但在雄性海膽生殖腺中的表達量明顯高于其在雌性海膽生殖腺中的表達量。由此說明，蝦夷馬糞海膽CYP17 基因與其生殖腺的生長和分化是有關(guān)聯(lián)的。另一方面，CYP17基因是合成雄激素的關(guān)鍵類固醇激素生成酶，對雌激素的合成也是必不可少的，該基因在雄性海膽性腺中的表達量高于雌性海膽是符合這一點的。從4 -1 家系3 個不同發(fā)育時間段雌、雄海膽性腺組織表達情況來看，CYP17 基因在蝦夷馬糞雌、雄海膽性腺中的表達量隨著日齡的增加而增加，其中雄性海膽3 個發(fā)育時間段的表達量變化較明顯，而雌性海膽生長期和成熟前期表達量變化不顯著，到成熟期表達量變化才開始顯著，這可能是由于雌、雄海膽生殖腺發(fā)育不同步所致，雄性海膽的生殖腺發(fā)育要比雌性的快一些，或者說CYP17 基因在蝦夷馬糞海膽雄性生殖腺中表達量高。CYP17 基因在不同家系同一生長期或同一家系同一日齡雌、雄生殖腺的差異表達水平，說明了蝦夷馬糞海膽在同一生長期(或日齡)雌、雄個體生殖腺發(fā)育不同步，雄性海膽的生殖腺發(fā)育要比雌性快，這與董穎等［17］的研究結(jié)果是一致的。

本研究結(jié)果初步證實了CYP17 基因與蝦夷馬糞海膽生殖腺生長、發(fā)育有關(guān)，在不同家系間、同一家系不同發(fā)育階段有較大的差異表達，且該基因在雄性海膽生殖腺中的表達水平顯著高于在雌性海膽生殖腺中的表達水平。

致謝:遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院赫崇波研究員、周遵春研究員、楊愛馥副研究員在試驗過程中給予了鼎力幫助，在此表示感謝!

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