劉丁才，朱洪光，許劍鋒*

1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306;2同濟(jì)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與工程研究院，上海 200092

沼渣是投入沼氣池內(nèi)的原料經(jīng)密封厭氧發(fā)酵后的固體殘留物，主要被作為有機(jī)肥和飼料添加來研究和開發(fā)利用［1，2］。沼渣是大中型沼氣工程厭氧發(fā)酵后的主要副產(chǎn)物之一，其內(nèi)含有豐富的沼渣纖維、氨基酸、B族維生素、生長素、抗生素、有機(jī)酸、植物激素

及各種水解酶等生物活性物質(zhì)［3］。研究還發(fā)現(xiàn)沼氣發(fā)酵殘留物對農(nóng)田普遍發(fā)生的近30種病害具有防治作用，至少有20多種病害的防治效果達(dá)到或超過了現(xiàn)行使用的農(nóng)藥效果［4］。但是沼渣還未能得到充分利用［5］，這既造成了資源的浪費(fèi)，又使能源環(huán)保型沼氣工程的建設(shè)和推廣受阻。因此，我們在大力發(fā)展大中型沼氣工程的同時(shí)，還應(yīng)加強(qiáng)沼渣的高值利用研究。為進(jìn)一步明確沼渣的化學(xué)成分，使其得到更充分有效的開發(fā)和利用，本研究對雞場沼渣進(jìn)行了化學(xué)成分分析，初步分離到6個(gè)化合物，經(jīng)鑒定，分別為 β-谷甾醇(1)、22β-羥基-12-齊墩果烯-3-酮(2)、21β-羥基-β-白檀酮(3)、29-羥基-12-土當(dāng)歸烯-3，22-二酮(4)、17β-雌二醇(5)、S(-)-雌馬酚(6)。這些成分均首次從雞場沼渣中分離得到。

其中，β-谷甾醇是一種植物固醇，多個(gè)在體和離體實(shí)驗(yàn)已證實(shí)其對結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌和子宮頸癌具有保護(hù)作用，且對人肝癌HepG2細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用［6］;最近研究表明17β-雌二醇除具有促進(jìn)生殖系統(tǒng)發(fā)育和維持生殖功能外，對心血管等器官還有保護(hù)作用，主要有抗炎作用、抗氧化作用、抗凋亡作用等［7］。21β-羥基-β-白檀酮屬于比較特殊的三萜，因?yàn)槠溆泻芎玫目鼓c賈第蟲(Giardia intestinalis，亦名Giardia lamblia)活性，對腸賈第蟲的半抑制濃度為 IC5027.4 μM［8］，而腸賈第蟲是人體腸道感染的常見寄生蟲之一，可引起腹痛、腹瀉和吸收不良等癥狀。雌馬酚屬非甾體類雌激素，有R(+)-雌馬酚和S(-)-雌馬酚兩種對應(yīng)異構(gòu)體，而S(-)-雌馬酚是大豆素(daidzein)在部分人和動(dòng)物腸道中特定微生物的代謝產(chǎn)物，至今發(fā)現(xiàn)的所有生物合成雌馬酚都屬S(-)-雌馬酚且具有多種生物活性，如很強(qiáng)的抗氧化性、很好的心血管疾病保護(hù)作用、有助于婦女更年期癥狀的改善，同時(shí)流行病學(xué)研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、體外實(shí)驗(yàn)也表明，S(-)-雌馬酚有抗乳腺癌、前列腺癌等作用［9］;而對化合物 22β-羥基-12-齊墩果烯-3-酮和 29-羥基-12-土當(dāng)歸烯-3，22-二酮的作用的研究，目前還沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

1 儀器和材料

Bruker AV-400型核磁共振儀，TMS為內(nèi)標(biāo)(Bruker公司);AB 3200 Q TRAP質(zhì)譜儀(ABI公司);AUTOPOL V plus旋光儀(Rudolph公司);柱層析硅膠(200～300目;硅膠H)及薄層色譜板均購自青島海洋化工廠;Sephadex LH-20(Pharmacia公司);石油醚(60～90℃)、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和甲醇均為上海國藥分析純。沼渣于2011年4月采自正常運(yùn)轉(zhuǎn)的上海市浦東新區(qū)六灶鎮(zhèn)文彬養(yǎng)雞場沼氣池，經(jīng)同濟(jì)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與工程研究院朱洪光教授鑒定為以雞糞為原料進(jìn)行產(chǎn)沼氣厭氧發(fā)酵的固體殘留物(Biogas residue)，沼渣標(biāo)本存于上海海洋大學(xué)食品學(xué)院海洋與生物制藥研究室。

2 提取分離

取與沼液分離的干沼渣1 Kg，用6 L無水甲醇攪拌浸提3次，每次1 d，浸提液用濾紙過濾后在50℃ 減壓濃縮得浸膏27.2 g。將浸膏與粗硅膠拌樣后進(jìn)行硅膠柱層析(200～300目)，分別用純氯仿、氯仿-甲醇(15∶1)洗脫得到A和B兩部分，質(zhì)量分別為10.1 g和5.3 g。A部分用硅膠柱層析(硅膠H)，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(100∶0，30∶1，15∶1，8∶1，3∶1)，以 10% 濃硫酸乙醇溶液為顯色劑進(jìn)行薄層色譜分析合并后經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析(硅膠H，石油醚-乙酸乙酯)，得化合物 1(18 mg)，2(11 mg)，3(25 mg)和4(27 mg)。B部分直接用無水甲醇溶解，以無水甲醇為洗脫液進(jìn)行 Sephadex LH-20洗脫純化，得化合物5(11 mg)和6(36 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 無色針狀晶體(MSO-EtOAc);ESIMS m/z:437.6 ［M+Na］+，分子式 C29H50O;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:5.37(1H，dd，J=5.2，2.3 Hz，H-6)，3.55(1H，tt，J=11.3，5.3 Hz，H-3)，2.31(1H，dd，J=13.0，5.0 Hz，H-4a)，2.27(1H，td，J=11.0，2.4 Hz，H-4b)，2.03(1H，dt，J=12.8，3.6 Hz，H-12a)，2.00(1H，td，J=12.1，2.4 Hz，H-8)，1.85-1.87(3H，m，H-1a，H-2a，H-16a)，1.68(1H，m，H-25)，1.03(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.89(3H，s，H-19)，0.85(3H，t，J=7.4 Hz，H-29)，0.85(3H，d，J=6.9 Hz，H-26)，0.84(3H，d，J=6.9 Hz，H-27)，0.71(3H，s，H-18);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:140.7(s，C-5)，121.7(d，C-6)，71.8(d，C-3)，56.7(d，C-14)，56.0(d，C-17)，50.1(d，C-9)，45.8(d，C-24)，42.3(s，C-13)，42.3(t，C-4)，39.7(t，C-12)，37.2(t，C-1)，36.5(s，C-10)，36.1(d，C-20)，33.9(t，C-22)，31.9(t，C-7)，31.8(d，C-8)，31.6(t，C-2)，29.1(d，C-25)，28.2(t，C-16)，26.0(t，C-23)，24.3(t，C-15)，23.0(t，C-28)，21.1(t，C-11)，19.8(q，C-26)，19.4(q，C-19)，19.0(q，C-27)，18.8(q，C-21)，12.0(q，C-29)，11.8(q，C-18)。以上質(zhì)譜和核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］報(bào)道的β-谷甾醇數(shù)據(jù)基本一致，鑒定化合物1為β-谷甾醇。

化合物2 白色粉末;ESI-MS m/z:441.2［M+1］+，分子式 C30H48O2;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:5.26(1H，t，J=3.6 Hz，H-12)，3.42(1H，t，J=5.1 Hz，H-22)，2.51(1H，ddd，J=15.4，11.0，7.4 Hz，H-2a)，2.36(1H，ddd，J=15.4，6.3，7.5 Hz，H-2b)，2.08(1H，d，J=14.5 Hz，H-18)，1.10(3H，s，H-27)，1.09(3H，s，H-23)，1.06(3H，s，H-25)，1.04(3H，s，H-24)，1.01(3H，s，H-30)，0.96(3H，s，H-26)，0.90(3H，s，H-29)，0.88(3H，s，H-28);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:217.8(s，C-3)，144.0(s，C-13)，122.6(d，C-12)，76.6(d，C-22)，55.3(d，C-5)，47.4(s，C-4)，46.9(d，C-9)，46.1(t，C-19)，45.0(d，C-18)，42.2(s，C-14)，41.5(t，C-21)，39.6(s，C-8)，39.3(t，C-1)，37.4(s，C-17)，36.7(s，C-10)，34.2(t，C-2)，32.7(q，C-29)，32.4(t，C-7)，30.5(s，C-20)，28.2(t，C-16)，28.2(q，C-30)，26.5(q，C-23)，25.8(t，C-15)，25.3(q，C-27)，23.6(t，C-11)，21.5(q，C-24)，20.0(q，C-28)，19.6(t，C-6)，16.9(q，C-26)，15.3(q，C-25)。以上質(zhì)譜和核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報(bào)道的22βhydroxy-12-oleanen-3-one數(shù)據(jù)基本一致，鑒定化合物 2 為 22β-羥基-12-齊墩果烯-3-酮。

化合物3 白色粉末;ESI-MS m/z:441.3［M+1］+，分子式 C30H48O2;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:5.25(1H，t，J=3.4 Hz，H-12)，3.53(1H，dd，J=12，4.6 Hz，H-21)，2.57(1H，ddd，J=16，11，7.2 Hz，H-2a)，2.38(1H，ddd，J=16，6.7，3.6 Hz，H-2b)，2.00(1H，dd，J=14.8，3.5 Hz，H-18)，1.65(1H，dd，J=11.5，6.3 Hz，H-9)，1.33(1H，m，H-5)，1.14(3H，s，H-27)，1.11(3H，s，H-23)，1.07(3H，s，H-25)，1.06(3H，s，H-24)，1.01(3H，s，H-26)，0.97(3H，s，H-29)，0.89(3H，s，H-28)，0.86(3H，s，H-30);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:217.8(s，C-3)，143.8(s，C-13)，124.0(d，C-12)，74.0(d，C-21)，55.3(d，C-5)，47.5(s，C-4)，47.1(t，C-19)，46.8(d，C-9)，46.7(d，C-18)，45.3(t，C-22)，41.9(s，C-14)，39.7(s，C-8)，39.1(t，C-1)，36.5(s，C-10)，36.3(s，C-20)，35.0(s，C-17)，34.2(t，C-2)，32.1(t，C-7)，29.1(q，C-29)，28.3(q，C-28)，28.2(t，C-16)，26.5(q，C-23)，26.0(t，C-15)，25.9(q，C-27)，23.7(t，C-11)，21.5(q，C-24)，19.6(t，C-6)，17.0(q，C-30)，16.7(q，C-26)，15.3(q，C-25)。以上質(zhì)譜和核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］報(bào)道的 21β-hydroxy-β-amyrenone 數(shù)據(jù)基本一致，鑒定化合物 3 為 21β-羥基-β-白檀酮。

化合物4 無色片狀晶體(MeOH);ESI-MS m/z:457.3［M+1］+，分子式 C30H48O3;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:5.33(1H，t，J=3.3 Hz，H-12)，3.32(2H，d，J=10.7 Hz，H-29)，2.59(1H，d，J=14.0 Hz，H-21a)，2.53(1H，ddd，J=15.3，11.0，7.3 Hz，H-2a)，2.38(1H，ddd，J=15.4，6.5，3.4 Hz，H-2b)，2.24(1H，t，J=13.8 Hz，H-19a)，1.21(3H，s，H-27)，1.08(3H，s，H-23)，1.06(3H，s，H-25)，1.04(3H，s，H-24)，1.00(3H，s，H-28)，0.99(3H，s，H-26)，0.88(3H，s，H-30);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:217.6(s，C-3)，217.0(s，C-22)，141.5(s，C-13)，123.8(d，C-12)，72.5(t，C-29)，55.3(d，C-5)，48.0(s，C-4)，47.5(s，C-17)，47.0(d，C-18)，46.8(d，C-9)，45.6(t，C-21)，42.0(s，C-14)，40.6(t，C-19)，39.8(s，C-8)，39.5(t，C-1)，39.0(s，C-20)，36.6(s，C-10)，34.1(t，C-2)，32.2(t，C-7)，26.8(t，C-16)，26.5(q，C-23)，25.3(q，C-27)，25.2(t，C-15)，23.6(t，C-11)，21.5(q，C-24)，21.0(q，C-30)，20.7(q，C-28)，19.6(t，C-6)，16.7(q，C-26)，15.2(q，C-25)。以上質(zhì)譜和核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報(bào)道的29-hydroxy-12-oleanene-3，22-dione數(shù)據(jù)基本一致，鑒定化合物4為 29-羥基-12-土當(dāng)歸烯-3，22-二酮。

化合物5 白色粉末;ESI-MS m/z:273.3［M+1］+，分子式 C18H24O2;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:8.70(1H，s，3-OH)，7.09(1H，d，J=12.6 Hz，H-1)，7.00(1H，dd，J=10.4，6.5 Hz，H-2)，6.99(1H，dd，J=16.1，4.2 Hz，H-4)，3.92(1H，s，17-OH)，3.89(1H，t，J=17.0，8.4 Hz，H-17)，2.81(2H，t，J=2.5，6.2 Hz，H-6)，2.17(1H，m，H-11a)，2.09(1H，m，H-9)，1.79(1H，m，H-14)，1.79(2H，m，H-15)，1.78(1H，m，H-7b)，1.78(1H，m，H-16a)，1.73(1H，d，J=11.8 Hz，H-12b)，1.32(1H，m，H-16b)，1.29(1H，m，H-11b)，1.26(1H，m，H-7a)，1.12(1H，d，J=11.8 Hz，H-12a)，0.98(3H，s，H-18);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:154.8(s，C-3)，137.1(s，C-5)，130.4(s，C-10)，126.0(d，C-1)，114.9(d，C-4)，112.7(d，C-2)，80.0(d，C-17)，49.5(d，C-14)，43.5(d，C-9)，42.8(s，C-13)，38.7(d，C-8)，36.5(t，C-12)，29.8(t，C-16)，29.1(t，C-6)，26.9(t，C-7)，26.0(t，C-11)，22.7(t，C-15)，11.3(q，C-18)。以上質(zhì)譜和核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］報(bào)道的17β-Estradiol(E2)數(shù)據(jù)基本一致，鑒定化合物5為17β-雌二醇。

化合物6 無色方晶(MeOH);ESI-MS m/z:243.1［M+H］+，分子式 C15H14O3;［α］20D=-27.4(c=0.14，MeOH);1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:7.08(2H，d，J=8.4 Hz，H-2'，H-6')，6.86(1H，d，J=8.2 Hz，H-5)，6.74(2H，d，J=8.5 Hz，H-3'，H-5')，6.31(1H，dd，J=8.2，2.4，H-6)，6.23(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，4.86(2H，s，4'-OH，7-OH)，4.18(1H，ddd，J=10.5，3.6，2.0 Hz，H-2a)，3.90(1H，t，J=10.5 Hz，C-2b)，3.01 ～ 3.06(1H，m，H-3)，2.80-2.89(2H，m，H-4);13C NMR(CD3OD，125 MHz)δ:157.6(s，C-7)，157.3(s，C-4')，156.2(s，C-9)，133.8(s，C-1')，131.1(d，C-5)，129.3(d，C-2'，C-6')，116.4(d，C-3'，C-5')，114.5(s，C-10)，109.1(t，C-6)，103.8(t，C-8)，72.2(t，C-2)，39.4(d，C-3)，33.04(t，C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14］報(bào)道的 S(-)-equol基本一致，故鑒定化合物6為S(-)-雌馬酚。

1 Abubaker J，Risberg K，Pell M.Biogas residues as fertilisers-Effects on wheat growth and soil microbial activities.Applied Energy，2012，99:126-134.

2 Lei ZM(雷趙民)，Dou XC(竇學(xué)誠)，Zhang H(張浩)，et al.Effect of biogas residue feed on swine carcass and meat quality and nutrition content.Chinese Journal of Eco-Agriculture(中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào))，2009，17:752-755.

3 Liu LX(劉麗雪)，Chen HT(陳海濤)，Han YJ(韓永俊).Determination and analysis of physical characteristics and fiber chemical composition of biogas residue.Transaction sof the CSAE(農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào))，2010，26:277-280.

4 Zhang WD(張無敵)，Song HC(宋洪川)，Ding Q(丁琪)，et al.Application of methane fermenative residues in control of crop diseases and insect pests.Research of Agricultural Modernization(農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究)，2001，22:167-170.

5 Zhang GZ(張國治)，Wu SB(吳少斌)，Wang HL(王煥玲)，et al.Survey and analysis on state quo of public intention for utilizing digestate from large and medium size biogas plants.China Biogas(中國沼氣)，2009，28:21-24.

6 Wang L(王莉).Effects of β-sitosterol on proliferation inhibition of human cervical carcinoma SiHa cells and associated mechanisms.Shanghai:Fudan University(復(fù)旦大學(xué))，PhD.2006.

7 Huo HL(霍洪亮).Study of the mechanism of 17β-estradiol on protection myocardial cells hypoxia/reoxygenation injury.Changchun:Northeast Normal University(東北師范大學(xué))，PhD.2010.

8 Mena-Rejón GJ，Pérez-Espadas AR，Moo-Puc RE，et al.Antigiardial activity of triterpenoids of root bark of Hippocratea excelsa.J Nat Prod，2007，70:863-865.

9 Cai L(蔡莉)，Wang PY(王培玉)，Zhang YM(張玉梅).Advances in research on equol-producing bacteria.World Chin J Digestology(世界華人消化雜志)，2010，18:1360-1365.

10 Xin XL(信學(xué)雷)，Wang HQ(汪漢卿)，Aisa HA(阿吉艾克拜爾·艾薩).Chemical constituentes from the seed of Nigella glandulifera Freyn.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2012，24:892-896.

11 Chiu HL，Wu JH，Tung YT，et al.Triterpenoids and aromatics from Derris laxiflora.J Nat Prod，2008，71:1829-1832.

12 David Cáceres-Castillo，Gonzalo J Mena-Rejón，Roberto Cedillo-Rivera，et al.21β-hydroxy-oleanane-typetriterpenes from Hippocratea excelsa.J．Nat．Prod，2007，70:863-865.

13 Jianxin Guo，Duclos Jr，Richard I，Kiran Vemuri V，et al.The Conformations of 17β-estradiol(E2)and 17α-estradiol as determined by solution NMR.Tetrahedron Lett，2010，51:3465-3469.

14 Liang G，Zhang T，Wang JM，et al.X-ray single-crystal analysis of(-)-(S)-equol isolated from rat’s feces.Chem Biodiversity，2005，7:959-963.