黃建民 李榮需 周玲 陳冬萍 劉永青 林周勝

強(qiáng)直性脊柱炎（Ankylosing Spondylitis AS）是一種類風(fēng)濕因子陰性，主要累及中軸關(guān)節(jié)和肌腱韌帶附著點(diǎn)的慢性進(jìn)行性炎癥疾病，可引起腰痛、晨僵、脊柱活動(dòng)受限、駝背畸形、外周關(guān)節(jié)受累、肌腱端炎、足跟痛等關(guān)節(jié)癥狀以及眼部前葡萄膜炎、心血管表現(xiàn)、肺部表現(xiàn)、骨質(zhì)疏松等關(guān)節(jié)外癥狀，AS致殘率高，早期確診對AS患者非常重要。AS與HLAB27（Human Leucocyte Antigen B27，人類白細(xì)胞抗原B27）關(guān)系密切已被公認(rèn)，90%以上的AS患者HLA-B27呈陽性。人們發(fā)現(xiàn)HLA-B27在基因水平上存在較大異質(zhì)性，存在多個(gè)等位基因，不同亞型有著不同的地域和人種分布特點(diǎn)。另外HLA-B27同一亞型在不同人群中與AS的關(guān)聯(lián)也可不同。本研究將對東莞地區(qū)HLA-B27陽性患者及健康人的HLAB27基因亞型進(jìn)行檢測，揭示本地區(qū)主要致病亞型及可能的保護(hù)亞型，并從HLA-B27基因亞型的動(dòng)態(tài)表達(dá)量揭示與AS的相關(guān)性，為本地區(qū)AS的防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2010年3月-2012年12月本院骨科門診HLA-B27陽性的AS確診患者100例（符合1983年修訂的紐約標(biāo)準(zhǔn)），男81例，女19例， 年齡13～70歲，平均（29±8.37）歲；HLA-B27陽性健康對照組30例，男24例，女6例，年齡14～65歲，平均（30±6.45）歲。兩組年齡、性別等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)儀器與試劑 BDcanto2流式細(xì)胞儀由美國BD公司生產(chǎn)，HLA-B27熒光抗體F1（FITC）、CD3熒光抗體F2（PE）、校準(zhǔn)微球和溶血素均來自BD公司。PCR儀器購自上海宏石SLAN，高速離心機(jī)購自ACI公司，型號PK121R。電泳儀購自Bio-Rad公司，型號PvowerPAC200，全血DNA提取試劑盒、PCR試劑盒購自寶生物大連有限公司，DNA測序儀由美國ABI公司生產(chǎn)，型號3130。

1.2.2 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)定性檢測外周血T淋巴細(xì)胞HLAB27 定性檢測：抽取HLA-B27陽性AS患者及HLA-B27陽性健康對照組外周靜脈血100 uL，EDTA抗凝，采用BD公司HLA-B27試劑盒，按照說明書步驟進(jìn)行，在BDcanto2流式細(xì)胞儀上檢測，結(jié)果判斷為陰性/陽性。

1.2.3 HLA-B27基因亞型測定 采用PCR-SSP（序列引物擴(kuò)增法）技術(shù)檢測HLA-B27陽性AS患者及HLA-B27陽性健康對照組HLA-B27亞型的DNA。酚氯法提取外周血液細(xì)胞DNA，按照WHO2009年公布的44個(gè)HLA-B27等位基因，選擇相關(guān)亞型的引物試劑盒，進(jìn)行DNA擴(kuò)增，凝膠電泳分離并用熒光染色來檢測PCR反應(yīng)的最終產(chǎn)物。

1.2.4 HLA-B27亞型的mRNA定量 熒光實(shí)時(shí)定量RTPCR技術(shù)檢測HLA-B27陽性AS患者及HLA-B27陽性健康對照組HLA-B27亞型的mRNA，Trizol法提取外周血液細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增，觀察和記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用（±s）表示，兩組HLA-B27mRNA 表達(dá)水平比較采用t檢驗(yàn)，對HLA-B27mRNA 表達(dá)水平與強(qiáng)直性脊柱炎患者疾病活動(dòng)指數(shù)進(jìn)行Pearson相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 100例HLA-B27陽性AS患者檢出HLA-B2704亞型55例，HLA-B2705亞型45例，30例HLA-B27陽性健康對照組檢出HLA-B2704亞型13例，HLA-B2705亞型12例，HLA-B2706亞型3例，HLA-B2709亞型2例。

2.2 100例HLA-B27陽性患者HLA-B27mRNA 表達(dá)水平最低值為1.16，最高值為37.01，均值（7.77±6.19），30例HLA-B27陽性健康對照組表達(dá)水平最低1.05，最高值2.10，均值（1.51±0.27），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）；HLA-B27陽性患者HLA-B27mRNA 表達(dá)水平與強(qiáng)直性脊柱炎患者疾病活動(dòng)指數(shù)密切相關(guān)（R=0.707）。

3 討論

AS是一種主要累及中軸關(guān)節(jié)的慢性進(jìn)行性炎癥疾病，臨床表現(xiàn)為腰、骶以及下肢關(guān)節(jié)疼痛，晚期患者脊柱僵硬、活動(dòng)受限。我國AS發(fā)病率約為0.3%，多見于中青年男性。AS致殘率高，早期確診對強(qiáng)直性脊柱炎患者非常重要。目前的AS確診方法主要是依靠臨床表現(xiàn)和影像學(xué)、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果。AS與HLA-B27關(guān)系密切已被公認(rèn)，90%以上的AS患者HLA-B27呈陽性。1973年Brewerton和Schlosstein[1-2]首次報(bào)道HLA-B27與AS相關(guān)以來，AS是迄今已知的HLA-B27與疾病關(guān)聯(lián)最強(qiáng)、最典型的疾病。因此臨床研究中找出本地區(qū)HLA-B27基因亞型及基因亞型表達(dá)量與AS的病情關(guān)系，為本地區(qū)AS的診治提供理論和臨床依據(jù)具有重要意義。

研究顯示，HLA-B27亞型在不同的種族和地區(qū)中分布情況不同。2009年WHO正式命名的HLA-B27等位基因已達(dá)44個(gè)，不同亞型有著不同的地域和人種分布特點(diǎn)[3]，如B2705亞型幾乎見于所有人種，但B2703亞型主要見于西非人群，而B2704亞型則是中國漢族人的優(yōu)勢亞型。另外HLA-B27同一亞型在不同人群中與AS的關(guān)聯(lián)也可不同。有報(bào)道認(rèn)為，2705、2704、2702亞型與AS的發(fā)生呈正相關(guān)，而2703、2708、2709、2707與AS的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)[4-6]，而2706亞型則被普遍認(rèn)為是AS的保護(hù)性基因。本研究顯示：本地區(qū)HLA-B27陽性患者僅發(fā)現(xiàn)2704與2705亞型，且2704亞型占55%，2705亞型占45%，HLA-B27陽性健康者發(fā)現(xiàn)4種亞型，2704亞型占43.33%，2705亞型占40%，2706亞型占10%，2709亞型占6.7%。揭示本地區(qū)主要亞型分布為2704亞型與2705亞型，且2704亞型為優(yōu)勢亞型，而2706亞型及2709亞型僅見于HLA-B27陽性健康者，提示2706亞型及2709亞型為本地區(qū)保護(hù)亞型。

HLA-B27在AS發(fā)生中的病理作用目前尚不十分清楚。作為一種重要的免疫分子，HLA-B27主要功能是與抗原結(jié)合并將其提呈給T淋巴細(xì)胞，這一功能在AS和正常人中都有表現(xiàn)。HLA-B27重鏈可以形成同源二聚體，大多數(shù)AS患者T淋巴細(xì)胞都能表達(dá)這種二聚體的配體，這說明HLAB27重鏈二聚體可能參與了AS的病理發(fā)生過程，而HLAB27可能在免疫過程中具有重要作用[7-8]。因?yàn)橥ㄟ^檢測HLA-B27基因亞型無法有效區(qū)分AS患者及HLA-B27陽性健康人，采用定量PCR檢測HLA-B27mRNA表達(dá)有可能解決這一問題。本研究對HLA-B27陽性AS患者及HLAB27陽性健康對照組均進(jìn)行了RT-PCR技術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)兩組HLA-B27mRNA表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002），HLA-B27陽性AS患者呈現(xiàn)高表達(dá)，而HLA-B27陽性健康對照組呈現(xiàn)低表達(dá)。這也說明了本地區(qū)雖然HLA-B27基因亞型無論是AS患者或是健康人均是2704及2705，基因亞型高表達(dá)者患病，低表達(dá)者未患病。同時(shí)提示基因型低表達(dá)的HLA-B27陽性健康者隨著基因亞型表達(dá)量增加可能成為AS患者，因此臨床工作中對HLA-B27陽性健康人進(jìn)行RTPCR技術(shù)檢測HLA-B27mRNA表達(dá)量，作為一種輔助診斷的有效手段，可以更早期發(fā)現(xiàn)AS患者，使AS的防治真正達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，將AS的致殘率降到最低。

AS患者關(guān)于其疾病活動(dòng)性評價(jià)，目前臨床大多數(shù)專家認(rèn)可的、應(yīng)用最為廣泛的是畢氏強(qiáng)直性性脊椎炎疾病活動(dòng)指數(shù)（BASDAI），它與腰椎MRI急性炎癥評分有很好的一致性[9]，雖然新的直性脊柱炎病情活動(dòng)度評分（ASDAS）在判斷AS患者病情活動(dòng)度時(shí)的敏感性稍高[10]，但畢氏法僅需患者對自身病情的主觀評價(jià)，無需MRI及過多的抽血化驗(yàn)等高成本檢查，在中國仍最常用，能夠反映患者的病變活動(dòng)性。本研究發(fā)現(xiàn)HLA-B27陽性患者HLA-B27mRNA 表達(dá)水平與AS患者畢氏疾病活動(dòng)指數(shù)密切相關(guān)（R=0.707），這也為進(jìn)一步從分子水平治療AS提供了有力證據(jù)，未來可能通過轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，降低AS患者的HLA-B27mRNA表達(dá)量來減輕AS患者的病情。但HLA-B27是人類基因中的一個(gè)等位基因，具有高度的多態(tài)性，不同地區(qū)及種族中存在明顯差異，仍需進(jìn)一步從轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控等分子水平作更多的研究[11]?？傊?，本研究揭示本地區(qū)HLA-B27基因主要致病亞型和可能的保護(hù)亞型，并從分子轉(zhuǎn)錄水平揭示了HLA-B27基因動(dòng)態(tài)表達(dá)量與強(qiáng)直性脊柱炎患者疾病活動(dòng)指數(shù)相關(guān)性，為臨床及早防治AS提供了新的理論依據(jù)，具有重要臨床意義。

[1]Brewerton D A，Hart F D，Nicholls A ，et al.Ankylosing spondylitis and HL-A27[J].Lancet，1973，1（7809）：904-907.

[2]Schlosstein L，Terasaki P I，Bluestone R，et al.High Association of an HLA antigen B27 with Ankylosing spondylitis[J].New England Med，1973，288（14）：704-706.

[3]Duanqchanchot M，Puapairoj C，Romphruk A，et al.HLA-B27 subtypes in Northern and Northeastern Thais，Karens，and Bamars determined by a high-resolution PCR-SSP technique[J].Tissue Antigens，2009，73（6）：590-594.

[4]Lopez-Larrea C，Sujirachato K，Mohra N K，et al.HLA-B27 subtypes in Asian patients with ankylosing spondilitis[J].Tissue Antigens，1995，45（3）：169-176.

[5]汪薇，李志強(qiáng).HLA-B27基因亞型與強(qiáng)直性脊椎炎的相關(guān)性研究[J].臨床輸血與檢驗(yàn)，2009，11（4）：376-379.

[6]汪薇，李志強(qiáng).HLA-B27基因亞型與強(qiáng)直性脊椎炎臨床特征的相關(guān)性研究[J].臨床輸血與檢驗(yàn)，2010，12（1）：31-35.

[7]Turner M J，Delay M L，Bai S，et al.HLA-B27 up-regulation causes accumulation of misfolded heavy chains and crrelates with the magnitude of the unfolded protein response in transgenic rats：Implications for the pathogenesis of spondylarthritis-like disease[J].Arthritis Rheum，2007，56（1）：215-223.

[8]Bowness P. HLA B27 in health and disease： a double-edged sword? [J].Rheumatology，2002，41（7）：857-868.

[9]孔慶聰，邵碩，劉衛(wèi)敏，等.磁共振聯(lián)合HLA-B27診斷早期強(qiáng)直性脊柱炎的應(yīng)用價(jià)值[J].實(shí)用放射學(xué)雜志，2012，28（7）：1083-1086.

[10]林旭娜，李宴，張勝利，等.強(qiáng)直性脊柱炎病情活動(dòng)度評分對強(qiáng)直性脊柱炎患者病情活動(dòng)性判斷的價(jià)值[J].中華內(nèi)科雜志，2012，51（3）：206-209.

[11]李夢遠(yuǎn)，姚中強(qiáng)，劉湘源.HLA-B27與強(qiáng)制性脊柱炎免疫學(xué)機(jī)制的研究進(jìn)展[J].生理科學(xué)進(jìn)展，2011，42（1）：16-20.