阮麗明 周艷潔 朱茂靈

毛細(xì)管電泳技術(shù)在臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

阮麗明 周艷潔 朱茂靈

本文簡(jiǎn)要介紹毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis，CE)技術(shù)的發(fā)展概況，重點(diǎn)綜述了CE技術(shù)在臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，并對(duì)該技術(shù)的應(yīng)用前景做出了展望。

毛細(xì)管電泳;檢驗(yàn);臨床應(yīng)用

毛細(xì)管電泳又稱高效毛細(xì)管電泳(high performance capillary electrophoresis，HPCE)，是以毛細(xì)管為通道分離帶電粒子或離子，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，依據(jù)樣品中各組分之間電泳分配和流速上的差異來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的新型液相分離分析技術(shù)。CE是80年代后期迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)并綜合了電泳和色譜技術(shù)兩者的優(yōu)點(diǎn)；由于它高效、快速、簡(jiǎn)便、自動(dòng)化操作和在檢測(cè)方面具有高分辨率、高靈敏度、重復(fù)性好等諸多特點(diǎn)，在短短幾年時(shí)間里就已經(jīng)成為蛋白質(zhì)、多肽、核酸及其他生物分子分離和分析的一項(xiàng)重要技術(shù)[1]。筆者對(duì)近年來(lái)毛細(xì)管電泳技術(shù)的概況及其臨床檢驗(yàn)應(yīng)用進(jìn)行綜述，旨在為相關(guān)研究提供參考。

1 CE發(fā)展概況

早期的電泳技術(shù)是由瑞典Uppsala大學(xué)的 Tiselies教授于上世紀(jì)三十年代創(chuàng)立的界面電泳，他利用電場(chǎng)將蛋白質(zhì)分子分成白蛋白和球蛋白等4個(gè)區(qū)帶[2]。隨后在1950～1960年間出現(xiàn)了紙上電泳，這一技術(shù)在醫(yī)學(xué)生物實(shí)驗(yàn)室被廣泛采用，依據(jù)大量檢測(cè)資料使我們對(duì)電泳圖譜和有關(guān)的臨床病理相溝通成為可能。另外支持介質(zhì)不斷改進(jìn)，各種電泳技術(shù)的不斷更新和應(yīng)用，使電泳區(qū)帶分離更清晰，臨床應(yīng)用更為廣泛。

傳統(tǒng)的電泳分離過(guò)程會(huì)產(chǎn)生焦耳熱使電解質(zhì)溶液的密度發(fā)生變化并產(chǎn)生對(duì)流擾亂分離區(qū)帶，使分離度下降，并限制了高壓電場(chǎng)的使用， 解決問(wèn)題的方法之一就可以利用小內(nèi)徑的分離管抗對(duì)流。 前人的研究工作從石英毛管到內(nèi)徑更細(xì)的聚四氟乙烯管, 盡管當(dāng)時(shí)未獲得所理想的的高分離柱效，但這些研究已顯示出了細(xì)內(nèi)徑毛細(xì)管給電泳分離帶來(lái)的優(yōu)越性，為CE的發(fā)展奠定了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1981年 Jorgenson和Lukacs[3，4]的研究標(biāo)志著CE 的誕生。他們首次使用30 kV的高電壓和內(nèi)徑為75um 的石英毛細(xì)管柱，產(chǎn)生出高于40 萬(wàn)理論塔板數(shù)的分離柱效，他們?cè)O(shè)計(jì)出簡(jiǎn)單的 CE裝置并從理論上推導(dǎo)出了毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)分離的效率公式。1983年，Hjerten[5]發(fā)明了把聚丙烯酰胺凝膠填充在毛細(xì)管中的毛細(xì)管凝膠電泳(CGE) 技術(shù)。1984 年，Terabe[6]開創(chuàng)了膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜技術(shù)(MEKC)。1985年，Hjerten[7]又報(bào)道了新的毛細(xì)管等電聚焦技術(shù)(CIEF)。于同年，Knox[8]等更進(jìn)一步發(fā)展了毛細(xì)管電色譜技術(shù)(CEC)，他們使用極細(xì)的液相色譜的材料來(lái)填充毛細(xì)管。 90年代起CE的技術(shù)應(yīng)用方面有了很大的發(fā)展，1990年改進(jìn)應(yīng)用紫外檢測(cè)器，1992年開發(fā)應(yīng)用激發(fā)誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器[9]，CE技術(shù)得到不斷改進(jìn)和更新，敏感性和分辨率進(jìn)一步提高。

目前以毛細(xì)管電泳法為載體的分離分析方法主要有毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜(MECC)、毛細(xì)管篩分電泳(CSE)、親和毛細(xì)管電泳(AEC)、毛細(xì)管電色譜(CEC)、毛細(xì)管等電聚焦電泳(CIEF)和毛細(xì)管等速電泳(CITP)等[10]。使得CE技術(shù)在臨床檢驗(yàn)的應(yīng)用分析領(lǐng)域具有更為廣闊的發(fā)展前景。

2 CE在臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的應(yīng)用

2.1血清蛋白質(zhì)分析 血清蛋白電泳通常是臨床上在無(wú)論何種原因引起的血液沉降率增加時(shí)都需要進(jìn)行的常規(guī)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)項(xiàng)目，它將有助于確診臨床報(bào)告的炎癥或感染的狀況及提示進(jìn)一步檢測(cè)其他項(xiàng)目。采用CE可分離血清蛋白，并能準(zhǔn)確計(jì)算各蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度，避免了凝膠電泳法染色、脫色過(guò)程中多種影響因素造成的誤差，CE法的結(jié)果重復(fù)性好，可信度高[11]。前清蛋白在血清中的濃度可表明營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，且是確定惡性腫瘤、炎癥、肝硬化、霍奇金病的重要指標(biāo)，多數(shù)電泳法難以分辨，而用CE法很容易分離定量，檢測(cè)波長(zhǎng)為214或200nm。CE不僅增加了清蛋白部分的分辯率，對(duì)雙清蛋白血癥檢測(cè)的靈敏度也有了很大的提高。CE提供了足夠的在α1區(qū)的分辯率以區(qū)分α1酸性糖蛋白與α1抗胰蛋白酶。在α2區(qū)的球蛋白區(qū)，α2巨球蛋白與觸球蛋白不易區(qū)分，但在β-球蛋白區(qū)具有高分辯率[12]。CE法對(duì)腎病、慢性感染、自身免疫病和肝硬化等多種疾病的免疫球蛋白分析有較好的優(yōu)勢(shì)。

2.2單克隆免疫球蛋白的特征鑒別 單克隆免疫球蛋白是一種過(guò)度合成的單一類型或亞型的異常免疫球蛋白。它的產(chǎn)生是由于單一克隆的惡性或高致敏B細(xì)胞的無(wú)限增殖，從而產(chǎn)生同源性的單克隆免疫球蛋白。單克隆免疫球蛋白組分的檢測(cè)運(yùn)用了各種與免疫學(xué)、血液學(xué)和生物化學(xué)等領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)和儀器。通過(guò)用特異性抗體包被的瓊脂糖凝膠球消除一個(gè)特殊的峰來(lái)指示是哪種單克隆成分，借此對(duì)免疫球蛋白的型、亞型和輕鏈型予以鑒定和分類[13]。這一技術(shù)提高了對(duì)該蛋白組分的分析與研究水平。

2.3血紅蛋白成分的分析 血紅蛋白病(hemoglobinopathy)是一組由于血紅蛋白(Hb)分子結(jié)構(gòu)異?；蛑榈鞍缀铣烧系K而引起的遺傳性血液病，前者稱為異常血紅蛋白病，后者稱為地中海貧血[14](簡(jiǎn)稱地貧)。在地貧高發(fā)區(qū)檢測(cè)出地貧高風(fēng)險(xiǎn)夫婦和預(yù)防地貧患兒出生是關(guān)系到提高我國(guó)出生人口素質(zhì)和實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育工作的一個(gè)重要任務(wù)。其中血紅蛋白(Hb)電泳是研究和分離異常血紅蛋白的有效方法，亦是診斷血紅蛋白分子病和地貧不可缺少的手段之一[15]。毛細(xì)管電泳法是在充滿電泳液的石英毛細(xì)管中進(jìn)行電泳的技術(shù)，在溶血試劑中進(jìn)行稀釋的紅細(xì)胞樣品，會(huì)被注射到毛細(xì)管的負(fù)極端，在高壓電的作用下競(jìng)相電泳分離，然后Hb會(huì)被靠近正極端的415nm光波檢測(cè)裝置檢測(cè)到[16]。通過(guò)毛細(xì)管電泳將蛋白質(zhì)分離，采用波長(zhǎng)為200nm氘光源和CCD探測(cè)器，對(duì)血紅蛋白成分分析靈敏度和分辨率高[17]。CE是一種敏感度和精確度較高的分析方法，具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)[18]。通過(guò)使用堿性pH緩沖液，正常和異常(或變異體)血紅蛋白按下列順序檢測(cè)出來(lái)，從陰極到陽(yáng)極依次為：δA’2(A2變異體)，C，A2/O-阿拉伯血紅蛋白(O-Arab)，E，S，D，G費(fèi)城血紅蛋白(G-Philadelphia)，F(xiàn)，A，Hope，Bart，J，N-巴爾的摩血紅蛋白(N-Baltimore)和 H。在CE區(qū)帶中不出現(xiàn)碳酸酐酶，不但可以鑒別出HbA2變異體，還能夠準(zhǔn)確檢測(cè)HbA、HbF、HbA2含量以及其他異常血紅蛋白，可用于診斷地中海貧血及其他血紅蛋白病[19]。

2.4尿蛋白質(zhì)分析 臨床醫(yī)生和生物學(xué)家關(guān)注的尿蛋白檢查的概念正在逐步更新。蛋白尿的分析得益于近年來(lái)重要的方法學(xué)的進(jìn)步，特別是根據(jù)分子量和所帶電荷來(lái)分離蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。當(dāng)今的生物學(xué)技術(shù)主要應(yīng)用電泳方法來(lái)檢測(cè)游離輕鏈，并用免疫學(xué)技術(shù)來(lái)分析它們的特性。免疫游離輕鏈?zhǔn)悄I臟損害的直接原因，最常見的是腎小管性或系統(tǒng)性。這一毒性的出現(xiàn)可以是在尿中顯現(xiàn)沉淀，也可以在間質(zhì)中沉積。在過(guò)去的幾年里，有關(guān)免疫球蛋白輕鏈毒性因素方面的認(rèn)識(shí)已有了很大的進(jìn)展。電泳異常條帶位于β或γ區(qū)的病例中有三分之二的情況存在本周氏蛋白。一條或多個(gè)條帶是根據(jù)尿液中單克隆免疫球蛋白存在與否進(jìn)行識(shí)別，并且與典型的腎損傷或腎功能不全相關(guān)[20]。游離輕鏈常常沉積在腎小管中，導(dǎo)致腎小管中毒。由于蛋白尿定量與腎臟損害相關(guān)，形成蛋白尿的特定蛋白性質(zhì)就反映了腎單位病變所在的位置和腎功能異常的發(fā)病機(jī)理。尿中特定蛋白的分析可以認(rèn)為是如同一個(gè)真正的生化活檢，它可即刻提供腎單位內(nèi)部的狀況[21]。

2.5肌紅蛋白分析 肌紅蛋白異常增高常在急性心梗后患者的血液和尿液中出現(xiàn)，而免疫比濁法難以測(cè)定低濃度的肌紅蛋白。但是，CE可在8 min內(nèi)快速分離尿中低濃度肌紅蛋白并與血紅蛋白相鑒別。

2.6脂蛋白分析 CE可將血漿脂蛋白分離出14個(gè)亞組分，如在分離緩沖液中加入表面活性劑，可在短時(shí)間內(nèi)對(duì)2個(gè)主要組分：高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)進(jìn)行定量，對(duì)LDL進(jìn)一步分離為3個(gè)亞組分： LDL、中密度脂蛋白(IDL)和極低密度脂蛋白(VLDL)，并對(duì)各組分的比例進(jìn)行推算，從而對(duì)脂蛋白異常提供不同脂肪代謝的信息。

2.7糖化血紅蛋白(HbA1 c)分析 血紅細(xì)胞中的血紅蛋白糖基化部分即為糖化血紅蛋白(HbA1 c)。HbA1 c的水平與測(cè)定前數(shù)周內(nèi)的血糖水平呈正線性相關(guān)，因此對(duì)糖尿病患者測(cè)定糖化血紅蛋白可了解過(guò)去一段較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的血糖水平。此測(cè)定并不能作為糖尿病的診斷，但可用于作為控制血糖的指標(biāo)，糖化血紅蛋白的量還可作為評(píng)價(jià)各種治療措施效果的標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用CE進(jìn)行Hb A1 c電泳能分離幾種糖蛋白的糖基構(gòu)型，可鑒別糖化血紅蛋白A1、A1 c和其他異構(gòu)體，對(duì)糖尿病的監(jiān)控具有重要意義。

2.8同工酶的分離 應(yīng)用CE技術(shù)對(duì)多種同工酶進(jìn)行了成功的分離。其方法是先使用CE法分離樣品形成同工酶區(qū)帶后，切斷電源，并加入含底物的緩沖液，酶催化底物顯色，進(jìn)一步形成可被檢測(cè)區(qū)帶，又接通電源，再次電泳，使被檢測(cè)的同工酶染色區(qū)帶先后通過(guò)檢測(cè)器，測(cè)定最大吸收峰值即測(cè)定和分析被分離的同工酶。如檢測(cè)淀粉酶P(胰)和S(唾液)型等，均可采用HPCE技術(shù)分離其同工酶。

2.9免疫復(fù)合物分析 CE可將免疫復(fù)合物從結(jié)合的抗原抗體中迅速分離出來(lái)，應(yīng)用熒光標(biāo)記單克隆抗體，經(jīng)LIF-CE檢測(cè)，檢測(cè)限可達(dá)毫克級(jí)，可用于混合液體中低濃度的免疫復(fù)合物鑒定。

2.10DNA片段和染色體分析 CE分離DNA分子需多聚物交聯(lián)劑如聚丙烯酰胺、聚乙二醇、甲基纖維素等材料添加到緩沖液中作為分子篩，可對(duì)相差一個(gè)甚至幾個(gè)堿基DNA高效分離。有作者[22]應(yīng)用CE做X連鎖隱性遺傳病研究，成功地對(duì)DNA限制片段進(jìn)行了基因多態(tài)性分析。研究表明CE可用于分析拾攜帶者及胎兒產(chǎn)前診斷。

2.11在治療藥物監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用 CE可簡(jiǎn)便快速分析生物樣品中各種有形的藥物成分。在藥理學(xué)研究、法醫(yī)學(xué)檢查及臨床毒理等方面也有廣泛應(yīng)用[23]。在糖尿病的治療監(jiān)測(cè)中，可檢測(cè)血中格列本脲的濃度以防止藥物使用不當(dāng)導(dǎo)致低血糖。

2.12其他小分子/離子的檢測(cè) CE能在3～4 min分離血和尿樣品中的血管造影劑含量、草酸鹽等弱陰離子，檢測(cè)尿樣中十幾種卟啉物質(zhì)和維生素C異構(gòu)體。在新生兒遺傳性有機(jī)酸尿癥篩查用CE可檢測(cè)到時(shí)多種有機(jī)酸標(biāo)志物。

3 展望

隨著CE技術(shù)在臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)方面的廣泛應(yīng)用，也必將帶來(lái)更多的挑戰(zhàn)，未來(lái)的CE技術(shù)在細(xì)胞和組織等復(fù)雜生物樣品體系中的臨床檢驗(yàn)分析將成為主要的的發(fā)展趨勢(shì)。生物樣品分析必然要求進(jìn)一步發(fā)展復(fù)雜樣品前處理富集技術(shù)和更靈敏的檢測(cè)技術(shù)。電泳方法的創(chuàng)新性研究主要體現(xiàn)在新分離模式的建立和電泳技術(shù)的聯(lián)用上，例如微乳液毛細(xì)管電動(dòng)色譜(M E E K C)、親和毛細(xì)管電泳(A C E)和芯片毛細(xì)管電泳等；還有將分子信標(biāo)技術(shù)與C E 技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行可變長(zhǎng)度寡 聚核苷酸識(shí)別和基因檢測(cè)[24]；探索利用 C E 對(duì) PC R 產(chǎn)物作 D N A 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析篩查點(diǎn)突變等[25]。近年來(lái)我國(guó)在電泳技術(shù)的臨床應(yīng)用上有了迅猛發(fā)展，尤其是陣列毛細(xì)管電泳儀已經(jīng)問(wèn)世,這將克服目前大多數(shù)商品化毛細(xì)管電泳儀只能進(jìn)行單根毛細(xì)管電泳的缺陷，這種高通量的新方法將會(huì)給后基因組時(shí)代的基因分析帶來(lái)革命性的變化[26]。CE技術(shù)作為一種重要的分析手段，隨著它的快速發(fā)展，必將在臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)方面有著更廣泛的應(yīng)用前景并在各種分析分離領(lǐng)域發(fā)揮巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

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廣西衛(wèi)生廳課題(項(xiàng)目編號(hào)：Z.2010014)；桂人口計(jì)生研(項(xiàng)目編號(hào)：01-2010-001)

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