劉 威

手工進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素

劉 威

長期從事血站血液檢測項(xiàng)目，特別是手工操作酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的過程中，發(fā)現(xiàn)其中諸多因素嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并歸納總結(jié)出注意事項(xiàng)，以供同行參考。

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)；影響因素

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（簡稱ELISA）是指酶免疫測定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用的 ELISA 法有雙抗體夾心法和間接法，前者用于檢測大分子抗原，后者用于測定特異抗體。

在血站的血液檢測項(xiàng)目中，除了轉(zhuǎn)氨酶項(xiàng)目外，病毒檢測均采用此方法，具有快速、敏感、簡便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。在沒有大范圍的使用核酸檢測的今天，始終作為檢測的唯一可靠的方法。

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)由于它的敏感性，而使實(shí)驗(yàn)當(dāng)中很多環(huán)節(jié)必須操作恰當(dāng)、合理，才能保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。這些環(huán)節(jié)即可歸納成人、機(jī)、料、法、環(huán)，它們的影響至關(guān)重要。

1 人的因素

“人”是影響檢驗(yàn)結(jié)果的首要因素；整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程完全在人的操控下進(jìn)行的，這就要求實(shí)驗(yàn)人員對實(shí)驗(yàn)步驟的熟練掌握和清晰的思路，不允許絲毫的馬虎和懈怠，要有高度的責(zé)任心和道德心，過硬的實(shí)驗(yàn)技能、專業(yè)水平及應(yīng)對實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的問題和狀況的分析與解決的能力，實(shí)驗(yàn)過程中不能帶有個(gè)人情緒，不能因?yàn)樯瞵嵤掠绊憴z驗(yàn)的操作，以至于涉及檢驗(yàn)結(jié)果的核對和判斷。

2 機(jī)的因素

“機(jī)”指的是儀器設(shè)備，它是順利完成實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，包括震蕩儀、孵育箱、洗板機(jī)、酶標(biāo)儀、加樣器等。

2.1 所使用的儀器必須是有國家批準(zhǔn)文號(hào)、并每年經(jīng)過質(zhì)檢部門檢定合格或廠家工程師定期維護(hù)正常，方能使用。

2.2 在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，應(yīng)確保儀器的工作狀態(tài)正常，事先預(yù)熱。如孵育箱，在實(shí)驗(yàn)前達(dá)到理想溫度；洗板機(jī)能否正常運(yùn)行；酶標(biāo)儀指示狀態(tài)是否正常；加樣器是否校準(zhǔn)，在檢定時(shí)間內(nèi)使用。

2.3 儀器設(shè)備使用后，應(yīng)進(jìn)行維護(hù)和定期保養(yǎng)；如用75%的酒精擦拭，對于運(yùn)行不暢的地方上潤滑油等；有些設(shè)備需要日維護(hù)，有些設(shè)備需要周維護(hù)，有些設(shè)備需要月維護(hù)；有些設(shè)備需要定期更換燈管等（如生物安全柜）。

2.4 在實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)儀器設(shè)備運(yùn)行不正常應(yīng)立即停止工作，上報(bào)總務(wù)科，與廠家工程師聯(lián)系，制定維修方案。并及時(shí)貼上“停止使用”標(biāo)識(shí)，最好移出工作空間，以免混用。

2.5 新引進(jìn)和檢修后的儀器設(shè)備使用前必須進(jìn)行確認(rèn)方可使用，并懸掛正常使用標(biāo)識(shí)。

3 料的因素

“料”是指物料和試劑；物料應(yīng)是有國家批準(zhǔn)文號(hào)的，并經(jīng)過計(jì)量檢定達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的，是經(jīng)久耐用型的；試劑應(yīng)選用有國家批準(zhǔn)文號(hào)并經(jīng)過行業(yè)比對排名靠前的產(chǎn)品，盡量使用第四代產(chǎn)品，（抗原抗體聯(lián)合檢測）可縮短抗原抗體的檢測時(shí)間；不同批號(hào)的試劑應(yīng)分開存放，不宜交叉使用，試劑開啟后要在一周內(nèi)用完，并堅(jiān)持優(yōu)先使用上一盒試劑所剩余微孔的原則，不可有過期試劑出現(xiàn)在試劑庫中[1]；從冰箱中取出的試劑盒必須放置30～60分鐘復(fù)溫至室溫方可實(shí)驗(yàn)；新進(jìn)的試劑必須在質(zhì)控科室確認(rèn)并貼有放行標(biāo)識(shí)后方可進(jìn)行試驗(yàn)。

4 法的因素

“法”即檢測方法—酶聯(lián)免疫吸附法（以下簡稱酶聯(lián)法）；實(shí)驗(yàn)室人員應(yīng)熟練掌握酶聯(lián)法的原理、操作步驟、影響因素及注意事項(xiàng)，以便正確的操作；其中包括標(biāo)本的處理、加樣、震蕩、孵育、洗板、顯色、終止等。

4.1 實(shí)驗(yàn)室人員收到標(biāo)本后應(yīng)認(rèn)真查對，對于不夠量、中重度乳糜、溶血、有凝塊、標(biāo)識(shí)不清的標(biāo)本拒收，并在質(zhì)控部門的監(jiān)督下重新留樣。對于合格標(biāo)本要及時(shí)分離血清，離心2500轉(zhuǎn)10分鐘，避免溶血，對于不能及時(shí)檢測的標(biāo)本應(yīng)妥善保存于4℃冰箱，和交接單一起保存。實(shí)驗(yàn)前務(wù)必復(fù)溫至室溫方可實(shí)驗(yàn)檢測；ELISA檢測盡量采用新鮮標(biāo)本，長時(shí)間凍存的樣本避免反復(fù)融凍[2]。

4.2 仔細(xì)閱讀說明書以了解實(shí)驗(yàn)中的操作步驟和注意事項(xiàng)，以確定陰性、陽性的孔數(shù)、位置和加樣量，反應(yīng)孵育溫度和孵育時(shí)間、洗滌的次數(shù)，顯色時(shí)間及終止等。

4.3 加樣過程中，必須使用檢定合格的加樣器，并垂直加樣，不可外溢或掛壁，影響加樣量，導(dǎo)致結(jié)果偏低；加樣吸頭不可反復(fù)使用，以免造成污染。

4.4 震蕩，加樣結(jié)束后必須用震蕩儀進(jìn)行震蕩，使其充分混合（有稀釋液的）幅度不可過大，以免造成樣本外濺。

4.5 洗滌次數(shù)不要超過說明書推薦的次數(shù)，洗液在反應(yīng)孔內(nèi)滯留的時(shí)間不宜過長；洗滌后拍板應(yīng)盡量干凈，避免孔內(nèi)有液體殘留，造成花板。

4.6 在加酶或顯色液時(shí)不可使用塑料滴管，應(yīng)使用加樣器，塑料滴管的量不準(zhǔn)確（和加樣器大約相差20%左右），而且不宜控制，造成顯色不統(tǒng)一，判斷錯(cuò)誤。

4.7 在孵育過程中應(yīng)用不干膠紙覆蓋板的表面，以防止污染和保持溫度；盡量使用有單獨(dú)小門的孵育設(shè)備，以避免多人多次開關(guān)孵育箱使孵育箱內(nèi)的溫度下降，嚴(yán)密監(jiān)控孵育時(shí)間，時(shí)間的過長或過短都會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的不準(zhǔn)確。

4.8 加顯色液時(shí)，不能在處于陽光直射的環(huán)境下，加顯色系統(tǒng)后要避光反應(yīng)，以免顯色過強(qiáng)；顯色時(shí)間嚴(yán)格按照說明書要求，過長會(huì)使顏色加深，過短會(huì)使反應(yīng)不完全，尤其是弱陽性。

4.9 在每次實(shí)驗(yàn)中，必須加入室內(nèi)質(zhì)控對照，與檢測樣品相同的條件進(jìn)行，以監(jiān)控實(shí)驗(yàn)的成功與否。

4.10 洗液必須當(dāng)天配制，當(dāng)天使用，不可和其它廠家的洗液混用，嚴(yán)格按照說明書上的配制比例配制，使用后有剩余的應(yīng)棄去，以防止細(xì)菌污染。

5 環(huán)的因素

這里的“環(huán)”是指實(shí)驗(yàn)中所處的環(huán)境，是實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的基礎(chǔ)，也是保證實(shí)驗(yàn)成功的前提。應(yīng)對實(shí)驗(yàn)的物理參數(shù)有充分的了解，如環(huán)境溫度（保持在18℃～25℃）、濕度（保持在30%～70%），并使用空調(diào)、加濕器等設(shè)備以控制其在適合的范圍內(nèi)；環(huán)境應(yīng)通風(fēng)（門窗應(yīng)有防蚊防蠅設(shè)施）、寬敞、視線良好、地面防滑、試驗(yàn)臺(tái)耐酸耐堿、有消防器材和措施、有洗眼設(shè)施并能采取必要的防護(hù)等。

在長期的實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)了上述諸多的影響因素，如果忽視了它，難免會(huì)造成假陰性或假陽性，了解并能夠很好的控制它是避免差錯(cuò)事故的必要手段。

[1] 張化濤,段延安.影響酶聯(lián)免疫檢測因素的分析[J].實(shí)用醫(yī)技雜志,2011(7).

[2] 李會(huì)英.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)影響因素的分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2007,4(10)： 985-986.

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1673-5846(2013)06-0297-02

吉林省遼源市中心血站，吉林遼源 136200