楊秀芳， 馬養(yǎng)民， 鄭敬海， 劉建軍， 康永祥

(1.陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 西安 710021； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

0 引言

窩兒七是小檗科(Berberidaceae)鬼臼亞科(Podophylloideae)山荷葉屬(Diphylleia)的中華山荷葉(DiphylleiasinensisLi.)，是我國(guó)特有植物，分布于陜西、甘肅、四川、湖北等地.其根莖和須根可供藥，根莖能消熱、涼血、活血、止痛，并具有瀉下作用.主治腰腿疼痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨蒸癆熱、跌打損傷、月經(jīng)不調(diào)等癥.須根能清熱敗毒、破血祛瘀、涼血，多用于婦科病[1].窩兒七的化學(xué)成分以木脂素類(lèi)化合物為主，該類(lèi)化合物主要應(yīng)用于抗腫瘤、治疣等[2,3].2001年，譚蘋(píng)等對(duì)40種秦嶺“七藥”最低抑菌濃度進(jìn)行測(cè)試，將測(cè)試“七藥”制成生藥原液，以不同的稀釋度與11種標(biāo)準(zhǔn)菌種共同培養(yǎng)， 觀察其抑菌作用，以傳統(tǒng)抗菌中藥黃連作為對(duì)照組.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，窩兒七藥液的抑菌作用明顯優(yōu)于黃連[4].為了進(jìn)一步研究窩兒七化學(xué)成分的活性作用，本文首次對(duì)從窩兒七分離純化得到的化合物的抑菌活性和鎮(zhèn)痛活性進(jìn)行了研究，期望從中獲得抑菌活性或鎮(zhèn)痛作用好的化合物，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用窩兒七提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

從窩兒七中分離純化得到的山奈酚，山奈酚糖苷，鬼臼毒素，鬼臼毒素糖苷，鬼臼毒酮，山荷葉素及山荷葉素糖苷[5].

1.1.2 供試菌種

細(xì)菌4株：大腸桿菌(Esherichiacoli)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacilussubtilis)；

真菌4株：蘋(píng)果腐爛病菌(Valsamali)、芍藥炭疽病菌(C.gloeosporioides)、煙草赤星病菌(Alternariaalternata)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum).

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)200.0 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1 000 mL.

NA培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH 7.4～7.6.121 ℃滅菌20 min.

1.1.4 動(dòng)物

雄性昆明種小鼠，18～22 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房提供(合格證號(hào)：SCXK(軍)2007-007).

1.2 儀器

SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、YX280B手提式壓力蒸汽滅菌鍋(上海三申醫(yī)療器械有限公司)、101-1型干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠)、DH5000B電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)、HZQ-Q全溫振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)、MK3型酶標(biāo)儀(Thermo電(上海)儀器有限公司、BS224S分析天平(格瑞恩科技發(fā)展有限公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌液制備

將在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的大腸桿菌(E.c)、綠膿桿菌(P.a)、金黃色葡萄球菌(S.a)、枯草芽孢桿菌(B.s)、蘋(píng)果腐爛病菌(V.m)、芍藥炭疽病菌(C.g)、煙草赤星病菌(A.a)、小麥赤霉病菌(F.g)從恒溫培養(yǎng)箱中取出，在滅菌后的超凈工作臺(tái)上將以上各菌接種至配制好的液體培養(yǎng)基中，再將接菌后的液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至全溫振蕩器，溫度恒定在28 ℃培養(yǎng)48 h，備用.

1.3.2 試樣制備方法

將從窩兒七中分離純化得到的山奈酚、山奈酚糖苷、鬼臼毒素、鬼臼毒素糖苷、鬼臼毒酮、山荷葉素及山荷葉素糖苷，分別稱(chēng)取0.2 mg，用2 mL二甲基亞砜溶解，備用.

鬼臼毒素水溶液：將窩兒七中分離得到的鬼臼毒素樣品用蒸餾水配制成5組鬼臼毒素水溶液，濃度分別為1 mg/kg、3 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg、100 mg/kg，每組10 mL,備用.

1.3.3 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

(1)取紫外消毒的96孔板，豎排依次編號(hào)A、B、C、D、E、F、G、H、I，橫排依次編號(hào)1、2、3、4、5、6、7、8(編號(hào)為A1、 A2、 A3、 A4、 A5、 A6、 A7、A8，B1-B8……H1-H8，I1-I8).選取一種稀釋過(guò)的菌懸液，在滅菌后的超凈工作臺(tái)上，用移液槍吸取100μL菌懸液放置在板孔中，重復(fù)此操作，在編號(hào)的孔板注入100μL菌懸液.

(2)在滅菌后的超凈工作臺(tái)上，取配制好的待測(cè)鬼臼毒素樣品，用移液槍吸取100μL注入在已有菌懸液的A1孔中、混勻.待菌懸液與鬼臼毒素樣品混勻后，再用移液槍從A1孔中吸取混合液體100μL，注入A2孔中，依次進(jìn)行倍半稀釋?zhuān)瑢1-A8孔分別注入鬼臼毒素樣品.最后，從A8孔中吸取出100μL混合溶液，棄掉.經(jīng)過(guò)此步操作A1-A8孔中均剩余100μL混合溶液，鬼臼毒素樣品濃度依次為50，25，12.5，6.25，3.12，1.56，0.75，0.38μg/mL.

(3)按照步驟(2)的操作，將B1-B8注入山荷葉素糖苷，C1-C8注入山奈酚，D1-D8注入山奈酚糖苷，E1-E8注入鬼臼毒酮，F(xiàn)1-F8注入山荷葉素，G1-G8注入鬼臼毒糖苷，H1-H8注入對(duì)照樣品，細(xì)菌對(duì)照樣品為青霉素鈉、硫酸鏈霉素，真菌對(duì)照樣品為酮康唑，I1-I8為空白對(duì)照.

(4)再取96孔板，按照步驟(1)至(3)把各個(gè)測(cè)試菌與各個(gè)測(cè)試樣品混合，完成后，將注入待測(cè)樣品與菌懸液的96孔板放入電熱恒溫培養(yǎng)箱中，溫度恒定在28 ℃培養(yǎng)24 h.用酶標(biāo)儀測(cè)各個(gè)板孔的透光度，再由透光度來(lái)計(jì)算各個(gè)樣品的抑制率[6].

式中：P─控制率；K0─溶劑對(duì)照孔；K1─樣品孔；K2─空白對(duì)照孔.

1.3.4 鎮(zhèn)痛活性測(cè)定(熱板法)

取雄性昆明小鼠35只，隨機(jī)分成7組.其中一組皮下注射生理鹽水，作為空白對(duì)照；一組皮下注射30 mg/kg阿司匹林水溶液，作為對(duì)照組；其余5組編號(hào)為鬼臼毒素a、b、c、d、e，分別皮下注射不同濃度的鬼臼毒素水溶液(給藥量為100 mg/kg、30 mg/kg、10 mg/kg、3 mg/kg、1 mg/kg)，每只小鼠注射量為0.2 mL.將注射藥品的小鼠尾部浸入50 ℃的熱水中，記錄其甩尾時(shí)間[7]，通過(guò)公式計(jì)算小鼠痛閾提高率：

式中：P─痛閾提高率；T─給藥后小鼠甩尾時(shí)間；T0─給藥前小鼠甩尾時(shí)間.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 化合物的抑菌活性

窩兒七中分離純化得到的山荷葉素(Ⅰ)、山荷葉素糖苷(Ⅱ)、山奈酚(Ⅲ)、山奈酚糖苷(Ⅳ)、鬼臼毒酮(Ⅴ)、鬼臼毒素(Ⅵ)及鬼臼毒素糖苷(Ⅶ)的MIC測(cè)試結(jié)果可以看出，各個(gè)化合物對(duì)測(cè)試的8種菌均有良好的抑制作用.表1為各樣品對(duì)測(cè)試細(xì)菌的MIC，從表中可以看出，山荷葉素、山荷葉素糖苷、山奈酚、山奈酚糖苷、鬼臼毒酮對(duì)于大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的MIC均不大于25μg/mL；鬼臼毒素與鬼臼毒素糖苷對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的MIC為12.5μg/mL，對(duì)于綠膿桿菌抑制作用最好，MIC為6.25μg/mL.表2為各樣品對(duì)測(cè)試真菌的MIC，由表看出山荷葉素、山荷葉素糖苷、對(duì)于蘋(píng)果腐爛病菌、芍藥炭疽病菌、煙草赤星病菌、小麥赤霉病菌的MIC均為25μg/mL；山奈酚、山奈酚糖苷對(duì)于芍藥炭疽病菌、煙草赤星病菌、小麥赤霉病菌的MIC為12.5μg/mL；鬼臼毒素與鬼臼毒素糖苷對(duì)蘋(píng)果腐爛病菌的MIC為12.5μg/mL，對(duì)芍藥炭疽病菌、煙草赤星病菌與小麥赤霉病菌的MIC為6.25μg/mL；鬼臼毒酮對(duì)蘋(píng)果腐爛病菌、小麥赤霉病菌的MIC為12.5μg/mL，對(duì)芍藥炭疽病菌、煙草赤星病菌的MIC為6.25μg/mL.結(jié)果表明鬼臼毒素類(lèi)化合物對(duì)真菌有良好的抑制作用.

表1 不同化合物對(duì)細(xì)菌最小抑菌濃度

其中Ⅷ：青霉素鈉，Ⅸ：硫酸鏈霉素.

表2 不同化合物對(duì)真菌最小抑菌濃度

其中Ⅹ：酮康唑.

2.2 鬼臼毒素的鎮(zhèn)痛活性

通過(guò)熱板法，按照1.2.4，測(cè)試不同濃度鬼臼毒素對(duì)小鼠痛閾值提高率隨時(shí)間變化的影響，研究鬼臼毒素的鎮(zhèn)痛活性，結(jié)果如圖1所示.

圖1 不同劑量的鬼臼毒素 鎮(zhèn)痛提高率隨時(shí)間的變化

從圖1中可看出鬼臼毒素對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛提高率與劑量呈依賴(lài)性，在濃度為1～100 mg/kg范圍內(nèi)，鎮(zhèn)痛效果隨劑量的增大而增大；同時(shí)隨時(shí)間的變化趨勢(shì)是鎮(zhèn)痛提高率先增大后減小，注射鬼臼毒素后15 min達(dá)最大.

圖2 鬼臼毒素與阿司 匹林鎮(zhèn)痛效果對(duì)比

圖2為同等劑量(30mg/kg)的鬼臼毒素與阿司匹林對(duì)小鼠鎮(zhèn)痛效果的比較，從圖2看出，當(dāng)濃度一定時(shí)，鬼臼毒素的鎮(zhèn)痛效果比阿司匹林的鎮(zhèn)痛效果明顯.但鎮(zhèn)痛作用時(shí)間與阿司匹林相比，持續(xù)時(shí)間短.

3 結(jié)束語(yǔ)

(1)窩兒七中含有豐富的具有生物活性的物質(zhì).分離純化得到的系列化合物(山奈酚，山奈酚糖苷，鬼臼毒素，鬼臼毒素糖苷，鬼臼毒酮)對(duì)細(xì)菌和真菌均有很好的抗菌活性；山荷葉素及山荷葉素糖苷對(duì)于細(xì)菌和真菌的抗菌活性相比之下稍差.其中鬼臼毒素及鬼臼毒素糖苷的抑菌作用最為顯著.

(2)窩兒七中分離純化得到的鬼臼毒素有一定的鎮(zhèn)痛作用，與阿司匹林相比，鬼臼毒素鎮(zhèn)痛作用見(jiàn)效快，但鎮(zhèn)痛作用時(shí)間短.

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[5] 馬養(yǎng)民，鄭敬海，劉建軍,等．太白七藥窩兒七化學(xué)成分的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(32)：19 781-19 782．

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[7] 徐叔云，卞如濂， 陳 修，等.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2002.