趙 冬 劉紅耀 趙 喚

1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原 030001；2.山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院（山西大醫(yī)院）泌尿外科，山西太原 030001

冬凌草甲素對膀胱癌T 24細(xì)胞增殖的抑制作用

趙 冬1劉紅耀2▲趙 喚1

1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原 030001；2.山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院（山西大醫(yī)院）泌尿外科，山西太原 030001

目的探討不同濃度的冬凌草甲素（ORI）在不同時間點對膀胱癌T24細(xì)胞增殖的抑制作用，為臨床決策提供參考依據(jù)。 方法 將冬凌草甲素作用于T24細(xì)胞，利用酶標(biāo)儀在不同時間點（λ=570nm）測定不同濃度的冬凌草甲素吸光度，同樣方式用MTT法檢測細(xì)胞的抑制率，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率，其數(shù)值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組結(jié)果由兩位研究者重復(fù)測量2次校對。 結(jié)果 隨著培養(yǎng)時間的延長及濃度的增加，T24細(xì)胞的吸光度數(shù)值呈明顯下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。濃度為8μmol/L時抑制率遞增，16μmol/L時抑制率已接近50%，而32μmol/L時抑制率最高可達70%以上，變化顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。隨時間、濃度梯度的變化，T24細(xì)胞凋亡率不斷增加，最高可達60%以上，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。證明冬凌草甲素對膀胱癌T24細(xì)胞增殖的抑制具有明顯的濃度-效應(yīng)與時間-效應(yīng)的關(guān)系。結(jié)論 冬凌草甲素可誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞凋亡，有明顯的抗腫瘤作用。

冬凌草甲素；T24細(xì)胞；吸光度；抑制；凋亡

冬凌草又稱為冰凌草、雪花草，因形似蝶狀冰凌片而得名，在冬凌草植被中提煉出的一種二萜類抗腫瘤天然有機化合物成分為冬凌草甲素（ORI）。近年來有大量文獻曾研究冬凌草具有抗腫瘤作用[1-2]，常用于食管癌、胃癌的治療，其無明顯毒副作用，效果較好[3]。臨床研究中曾報道，冬凌草有明顯的抑制膀胱腫瘤的作用[4]，車憲平等[5]也曾研究過預(yù)防小鼠膀胱癌的復(fù)發(fā)，具體作用機制尚不明確?；诖耍敬螌嶒炘囂接慜RI對膀胱癌T24細(xì)胞增殖的抑制作用及機制。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑

冬凌草甲素 （上海雙博生物科技有限公司111721-200602），二甲基亞砜（DMSO， BIOSHARP 公司 0231），T24細(xì)胞（上海瑞齊生物科技有限公司RS20230），1640培養(yǎng)液（北京賽默飛世爾生物公司SH30809），小牛血清（杭州四季青公司121005），磷酸鹽緩沖液（PBS，solarbio公司P1022-500），四甲基噻唑藍(lán)（MTT，sigma M-2122），Avnnexin V-FITC試劑盒（碧云天生物科技有限公司C1062），Hoechst 33258（Sigma公司 20051201）。

1.2 儀器及設(shè)備

超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司），二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司），酶標(biāo)儀（美國貝克曼公司），電子、倒置顯微鏡（奧林巴斯電子公司），流式細(xì)胞儀及配套鞘液 （美國貝克曼公司），離心機 （德國RUMAZENTRIFUGEN），-80℃冰箱及 4℃冰箱 （日本 SANYO公司），96孔培養(yǎng)板（上海喬躍電子有限公司），電熱恒溫水浴箱（上海博迅實業(yè)有限公司）。

1.3 操作方法

細(xì)胞培養(yǎng)：將T24細(xì)胞放置于含有10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃二氧化碳培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，每1天換液1次，收集對數(shù)生長期的細(xì)胞進行實驗。

細(xì)胞吸光度的測定：2.5mmol/LDMSO加入含有冬凌草甲素的培養(yǎng)瓶中，分別添加 10μL、20μL、40μL，將其冬凌草甲素的濃度調(diào)制為 8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L；以相同濃度的PBS溶液加入到培養(yǎng)瓶中作為對照組，用酶標(biāo)儀（λ=570nm為測試波長，λ=630nm為參考波長）讀取吸光度A值。

細(xì)胞抑制率的測定：取對數(shù)增長期的T24細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL，接種于96孔板上，每孔加入細(xì)胞懸液100μL，培養(yǎng) 10h 后分別加入 8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L濃度的冬凌草甲素，以加入相同濃度的PBS溶液作為對照，培養(yǎng)48h后，分別加入5g/LMTT溶液20μL，再培養(yǎng)4h后取出，離心去上清液，再分別加入PBS溶液150μL振蕩搖勻，顯微鏡下觀察其著色粒消失后以λ=570nm測試波長，λ=630nm為參考波長讀取吸光度A值，并通過吸光度值計算細(xì)胞抑制率（Apbs-Aori）/Apbs，其中Apbs為磷酸鹽緩沖液的吸光度值，Aori為冬凌草甲素的吸光度值。

細(xì)胞凋亡率的測定：根據(jù)Avnnexin V-FITC試劑盒說明操作， 將三個濃度為 8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L 的冬凌草甲素分別加入到不同時間點的T24培養(yǎng)瓶里（懸浮在500μL 緩沖液中），并各自加入 5uL Avnnexin V-FITC，避光放置5min后，行流式細(xì)胞儀檢測。凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/（凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù)）。

上述濃度的培養(yǎng)瓶分別在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中存放，12h、24h、48h后進行數(shù)據(jù)測定，并由兩位研究者重復(fù)測量2次校對。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)以表示，組間比較擬用單因素方差分析（ANOVA），組內(nèi)比較以配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素對膀胱癌T24細(xì)胞吸光度的變化分析

隨著時間及ORI濃度的增長，各梯度的膀胱癌T24細(xì)胞吸光度值明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），即活性細(xì)胞逐漸減少，吸光度值與其時間及濃度梯度呈負(fù)相關(guān)，提示ORI對膀胱癌移行細(xì)胞癌細(xì)胞有抑制作用，并與其時間及濃度梯度呈正相關(guān)。（PBS對照組各梯度膀胱癌T24細(xì)胞吸光度值變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05）。見表1。

表1 ORI對膀胱癌T24細(xì)胞吸光度變化（n=20）

2.2 冬凌草甲素對膀胱癌T24細(xì)胞增殖的抑制分析

隨著時間梯度抑制率組內(nèi)比較分析可見：3個時間點的數(shù)值兩者比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。組間比較分析可見：3個濃度的數(shù)值隨不同時間兩者比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（PBS對照組各梯度膀胱癌T24細(xì)胞抑制率無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05），見表2。

2.3 冬凌草甲素誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞凋亡率分析

3個濃度的細(xì)胞凋亡率隨不同時間比較結(jié)果見表3。3個時間點的數(shù)值兩者比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。組間比較分析可見：3個濃度的數(shù)值隨不同時間兩者比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（PBS對照組各梯度膀胱癌T24細(xì)胞凋亡率變化不顯著，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P ＞ 0.05）。

表2 ORI對膀胱癌T24細(xì)胞增殖的抑制率（%，±s，n=20）

表2 ORI對膀胱癌T24細(xì)胞增殖的抑制率（%，±s，n=20）

時間梯度 8μmol/L 16μmol/L 32μmol/L 12h 24h 48h 11.31±0.9214.26±1.1816.01±0.9514.27±0.3121.53±1.9847.42±2.0522.74±1.8749.86±2.9172.55±2.27

表 3 ORI誘導(dǎo)膀胱癌 T24細(xì)胞凋亡率（%，±s，n=20）

表 3 ORI誘導(dǎo)膀胱癌 T24細(xì)胞凋亡率（%，±s，n=20）

?

3 討論

冬凌草甲素具有抗腫瘤作用，其機制尚未明確，作用機制可能阻滯了細(xì)胞的生長，延緩了細(xì)胞周期并誘導(dǎo)其凋亡[6-8]，細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種生物學(xué)現(xiàn)象，由基因控制其主動死亡[9]。本次實驗研究結(jié)果顯示：T24細(xì)胞吸光度值的降低，是冬凌草甲素抑制了細(xì)胞的活性所致，吸光度值與其時間、濃度梯度呈負(fù)相關(guān)，提示ORI對T24細(xì)胞有抑制作用，并與其時間及濃度梯度呈正相關(guān)。冬凌草甲素可能通過多種途徑來殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制細(xì)胞增殖，限制腫瘤細(xì)胞鈉泵活性，影響細(xì)胞生長，因腫瘤的增長需攝入大量營養(yǎng)物質(zhì)，并靠鈉泵來維持循環(huán)[10]，此實驗表明，冬凌草甲素對膀胱癌T24細(xì)胞活性的抑制具有明顯的濃度-效應(yīng)與時間-效應(yīng)的關(guān)系。從生物膜轉(zhuǎn)運的途徑可以證實冬凌草甲素具有抗腫瘤的作用。

冬凌草甲素對膀胱癌T24細(xì)胞的抑制分析中可見隨時間及濃度梯度的增加，抑制率升高，冬凌草甲素抑制癌細(xì)胞增殖效果明顯。其機制可能與冬凌草甲素抑制癌細(xì)胞DNA、RNA及蛋白合成有關(guān)，王綿英等[11-12]研究了冬凌草甲素對DNA、RNA、蛋白質(zhì)合成的影響，結(jié)果為冬凌草甲素可迅速抑制其腫瘤DNA的形成；U細(xì)胞試驗中隨時間的延長，細(xì)胞明顯增多，標(biāo)記細(xì)胞的顆粒計數(shù)明顯減少，兩個試驗均驗證了冬凌草甲素參與了DNA合成的抑制過程。

冬凌草甲素誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞凋亡率分析中已明確了隨時間及濃度梯度的增長，凋亡率數(shù)值呈大幅度上升趨勢。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是一種特殊的細(xì)胞死亡方式，其作用機制可能為一定濃度的冬凌草甲素作用于腫瘤細(xì)胞后，細(xì)胞相互分散，貼壁生長的細(xì)胞減少，細(xì)胞體積減小萎縮，細(xì)胞核固縮，凋亡小體出現(xiàn)[13-14]。

綜上所述，此次實驗再次證明冬凌草甲素具有明顯的抗腫瘤作用，可抑制膀胱癌T24細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，冬凌草甲素是一種活性較好的抗腫瘤中藥制劑，具有較好的臨床應(yīng)用價值，雖抗腫瘤的作用機制需進一步深入研究，但能為改善膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)率開辟新的治療途徑。

[1]Fujita T，Takeda Y，Sun H D，et al.Cytotoxic and anti-tumor activities of Rabdosia diterpenoids[J].Planta Med，1988，54（5）：414-417.

[2]Zhang CL，Wu LJ，Tash iro AI，et al.Oridonin induced HeLa cell apoptosis through caspase pathway[J].Chin Pharmacol Bull，2003，19（5）：521-525.

[3]王瑞林，王留興.冬凌草治療食管癌、賁門癌95例臨床療效結(jié)果[J].腫瘤防治研究，1984，11（2）：86-87.

[4]徐培元，趙高賢，常連勝，等.冬凌草液熱療預(yù)防淺表性膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)的非隨機同期對照研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，25（12）：1115-1117.

[5]車憲平，韓瑞發(fā)，肖勁逐，等.冬凌草甲素和冬凌草多糖膀胱灌注治療C57BL/6小鼠膀胱腫瘤的療效及機制[J].中國病理生理雜志，2010，26（7）：1410-1415.

[6]Kang N，Zhang JH，Qiu F，et al.Inhibition of EGFR signaling augments orid on in-induced apoptosis in human laryngeal cancer cells via enhancing oxidative stress coincident with activation of both the intrinsic and extrinsic apoptotic pathways[J].Cancer Lett，2010，294（2）：147-158.

[7]Cheng Y，Qiu F，Ye Y C，et al.Oridon in induces G2/M arrest and apoptosis via activating ERK-p53apoptotic pathway and inhibiting PTK-Ras-Raf-JNK survival pathway in murine fibro sarcom a L929cells[J].Arch Biochem Biophys，2009，490（1）：70-75.

[8]Liu J J，Wu X Y，Xiang J P，et al.Antipro liferation effects of oridon in on HL-60cells[J].Ann Hem atol，2004，83（11）：691-695.

[9]黃健，魏秀巖，孫博航，等.冬凌草甲素誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞凋亡機制的研究[J].中國現(xiàn)代中藥，2010，12（12）：28-32.

[10]張典瑞，任天池.冬凌草甲素的藥學(xué)研究進展[J].中國藥學(xué)雜志，2003，38（11）：817-820.

[11]王綿英，林晨，張覃林.用放射自顯影術(shù)研究冬凌草甲素對L1210細(xì)胞 DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成的影響[J].中國藥理學(xué)報，1987，8（2）：164.

[12]王綿英，壽馬鋼，張覃林.用顯微光度術(shù)和放射自顯影相結(jié)合的方法研究冬凌草甲素對小鼠白血病L1210和小鼠S180細(xì)胞動力學(xué)的影響[J].河南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1986，21（1）：24.

[13]馮長偉，潘祥林，鄒俊暉，等.冬凌草甲素誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的研究[J].山東醫(yī)藥，2000，40（6）：7.

[14]王筠，劉清蕓，華海嬰，等.冬凌草甲素誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡[J].中國藥理學(xué)報，2001，17（4）：402.

Inhibiting effect of Oridonin on proliferation of bladder cancer T24cells

ZHAO Dong1LIU Hongyao2▲ ZHAO Huan11.Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2.Department of Urology,Shanxi Academy of Medical Science(Shanxi Hospital),Taiyuan 030001,China

ObjectiveTo investigate the inhibiting effect of Oridonin,in different concentrations and at different time points,on the proliferation of bladder cancer T24cells,and provide reference for clinical decision making.MethodsThe T24cells were affected by Oridonin.At different time points(λ=570nm)and in different Oridonin concentrations, the Oridonin absorbance was determined by microplate reader,the inhibition rate by MTT method,and cell apoptosis rate by flow cytometry.The results of determination were expressed as mean±standard deviation.The determination of each set of results were repeated and proofreaded by two researchers.ResultsAs the incubation time prolonged and concentration increased,T24cells absorbance values were showed a downward trend with statistically significant difference (P ＜ 0.05).The inhibition rate was steadily increased when the Oridonin concentration was 8μmol/L,near 50%when 16μmol/L,and up to more than 70%when 32μmol/L with statistically significant difference (P ＜ 0.05). As the change of time and concentration gradient,the apoptosis rate of T24cells was an escalation and up to more than 60%with statistically significant difference(P＜0.05).It was proved that the proliferation inhibition of Oridonin to bladder cancer T24cells has significant relationship of concentration-effect and time-effect.ConclusionOridonin can induce apoptosis of bladder cancer T24cells and has significant anti-tumor effect.

Oridonin;T24cells;Absorbance;Inhibition;Apoptosis

R737

A

1674-4721（2013）05（b）-0004-03

趙冬（1981-），性別：男；學(xué)歷：碩士；籍貫：山西太原；山西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，研究方向：泌尿系腫瘤。

▲通訊作者：劉紅耀（1965-），性別：男；籍貫：山西太原；學(xué)歷：博士；職稱：教授，山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院（山西大醫(yī)院）泌尿外科，研究方向：主要從事泌尿系腫瘤方向的研究。

2013-02-05 本文編輯：魏玉坡）