劉麗娟 宋適恒 李 鑫 蔡 麗 李艷佳 (河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科，河北 石家莊 05003)

銀屑病俗稱牛皮癬，是一種常見的紅斑鱗屑性皮膚病〔1〕，具有多基因的家族遺傳性〔2〕，是一種原因未明的慢性皮膚病，但具體發(fā)病機(jī)制仍未清楚。銀屑病具有治療困難、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響病患的生活質(zhì)量〔3～6〕。目前研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)〔7，8〕。樹突細(xì)胞(DCs)是體內(nèi)“專職的”抗原呈遞細(xì)胞(APC)，是體內(nèi)唯一能夠激活“初始型”免疫反應(yīng)的細(xì)胞，對機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)起著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)擬探討銀屑病患者外周血DCs功能與銀屑病發(fā)病的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 尋常型銀屑病門診患者50例，其中男22例，女28例，年齡20～58〔平均(39±17.6)〕歲，均為進(jìn)行期患者，就診前至少2個月內(nèi)未用過皮質(zhì)類固醇和免疫抑制劑治療。正常健康對照組為醫(yī)院職工和學(xué)生志愿者共50例，其中男20例，女30例，年齡21～52〔平均(36±11.2)〕歲。抽血前均征得患者和志愿者的同意。

1.2 主要儀器及試劑 Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀，美國Beckman Coulter公司。鼠抗人CD80-FITC單克隆抗體(MAB104)、鼠抗人CD83-FITC單克隆抗體(HB15a)，美國Beckman Coulter公司。IL-12 ELISA試劑盒，上海西唐生物科技有限公司。重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)及重組人白介素-4(rhIL-4)，PEPROTECH Asia公司。

1.3 方法

1.3.1 外周血DCs的制備 取銀屑病及正常健康人外周靜脈血5 ml(肝素抗凝)，使用淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)方法分離制備外周血單個核細(xì)胞(PBMC)。生理鹽水洗滌細(xì)胞3次。用含15%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×109個/L，加入到6孔培養(yǎng)板中(3 ml/孔)，放入37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后，棄去培養(yǎng)液，用37℃預(yù)溫的 RPMI1640培養(yǎng)液輕輕洗去未貼壁的細(xì)胞，獲得的貼壁細(xì)胞即為擬誘導(dǎo)DCs的單核細(xì)胞(因?yàn)閱魏思?xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)時具有短時貼壁的能力)。向6孔板中每孔貼壁細(xì)胞中加入含有15%胎牛血清、50 μg/L rhIL-4和rhGM-CSF細(xì)胞因子的RPMI1640培養(yǎng)液3 ml，放入37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日半量換液(吸出30%，加入60%)。同時補(bǔ)充相應(yīng)的細(xì)胞因子。每次換液吸出的培養(yǎng)液均用離心機(jī)離心保留培養(yǎng)液中懸浮的細(xì)胞。培養(yǎng)6 d后收集懸浮的細(xì)胞，即誘導(dǎo)的DCs，同時收集細(xì)胞培養(yǎng)液檢測IL-12水平。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測DCs表型 將收集的DCs用生理鹽水洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×1010個/L，每例標(biāo)本取細(xì)胞懸液0.4 ml分別放入4個試管(0.1 ml/管)，分別加入 CD80、CD83及相應(yīng)的同型對照抗體?；靹蚝螅覝乇芄夥胖?0 min，生理鹽水洗滌2次，加入1 ml生理鹽水，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測DCs分泌IL-12水平取在誘導(dǎo)DCs實(shí)驗(yàn)中收集到的細(xì)胞培養(yǎng)液，利用常規(guī)的ELISA方法檢測IL-12水平，具體操作步驟按照IL-12 ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)，計量資料采用±s表示。

2 結(jié)果

2.1 DCs培養(yǎng)及其形態(tài) 人外周血分離的單個核細(xì)胞在37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h后于倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞開始貼壁，并有聚集成團(tuán)的現(xiàn)象，且貼壁細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，少數(shù)有樹突狀突起;培養(yǎng)第2～3天可見細(xì)胞分散，細(xì)胞體積增大，多數(shù)細(xì)胞有明顯的樹突狀突起，并有少數(shù)細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)生長;培養(yǎng)第6天，僅有一小部分細(xì)胞貼壁生長，大部分細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)生長，即所需要的DCs。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)方法檢測DCs中CD80及CD83表達(dá)水平銀屑病患者外周血中DCs上CD80及CD83的陽性表達(dá)率分別為(75.15±2.76)%、(72.43±1.94)%，顯著高于正常健康人外周血中 DCs上 CD80及 CD83的陽性表達(dá)率(57.88±3.21)%、(41.86±2.54)%(P ＜0.01)。

2.3 ELISA檢測DCs分泌IL-12細(xì)胞因子含量 銀屑病患者外周血DCs分泌IL-12細(xì)胞因子含量(282.80±23.26)，顯著高于正常健康人外周血DCs分泌IL-12細(xì)胞因子含量(191.64±15.55)(P＜0.01)。

3 討論

銀屑病是一種常見的紅斑鱗屑性皮膚病，發(fā)病機(jī)制目前尚未闡明，但多數(shù)研究認(rèn)為其與機(jī)體免疫功能密切相關(guān)，可能是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病〔9〕。越來越多的研究集中在Th細(xì)胞功能異常與銀屑病的關(guān)系上〔10〕，研究顯示，銀屑病患者免疫系統(tǒng)Th1/Th2平衡紊亂，其中Th1更占優(yōu)勢〔11〕。

DCs是一組具有可塑性的非淋巴樣單核細(xì)胞，在體內(nèi)分布極為廣泛，是目前已知功能最強(qiáng)的APC，來源于骨髓造血干細(xì)胞，以未成熟的形式存在于循環(huán)系統(tǒng)中并廣泛分布于外周組織。外周血中存在幾種DCs前體細(xì)胞，單核細(xì)胞、類漿細(xì)胞DC(pDC)，郎格漢前體細(xì)胞，其中單核細(xì)胞可分化為髓系DCs。外周血及組織中的未成熟的DCs受到刺激并遷移至二級淋巴組織中成為成熟的DCs，在此過程中其細(xì)胞表型也發(fā)生了很大的變化，DCs成熟標(biāo)志物CD83表達(dá)量逐漸增多，并分泌多種細(xì)胞因子(如IL-4、IL-10、IL-12等)，從而調(diào)控機(jī)體免疫功能。

PBMC在rhGM-CSF及rhIL-4誘導(dǎo)下可向DCs分化。CD80被認(rèn)為是DCs表面標(biāo)志，常用于監(jiān)測DCs的表達(dá)，CD83是成熟DCs的特異標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)中檢測銀屑病患者PBMC在細(xì)胞因子rhGM-CSF及rhIL-4誘導(dǎo)下向DCs分化能力較正常健康人增強(qiáng)，DCs中CD80及CD83表達(dá)率顯著增高，提示銀屑病患者DCs表達(dá)及活化程度發(fā)生紊亂，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂。而且，銀屑病患者DCs分泌IL-12表達(dá)量顯著高于正常健康人，IL-12表達(dá)量的異常增高，引起Th1/Th2平衡紊亂，使Th1占優(yōu)勢，從而引起銀屑病的發(fā)生，調(diào)控DCs的功能將有助于銀屑病治療。

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