曹 巖 申葉春 張 凡 常永霞 張 斌 (張家口市第一醫(yī)院口腔科，河北 張家口 075000)

實(shí)體腫瘤的浸潤(rùn)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移均需要血管生成，腫瘤新生血管密度是評(píng)估患者轉(zhuǎn)移及預(yù)后的重要指標(biāo)，而新生血管內(nèi)皮主要的標(biāo)記物為CD105。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C(VEGF-C)是目前所知作用最強(qiáng)的血管生長(zhǎng)因子，在腫瘤血管形成過程中起重要作用，并與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān);轉(zhuǎn)移抑制基因nm23是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，腫瘤組織該基因的表達(dá)降低是實(shí)體瘤浸潤(rùn)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的必要條件。VEGF-C和nm23在口腔鱗癌中的表達(dá)與微血管密度(MVD)及其口腔鱗癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系目前尚不明確。本文探討口腔鱗癌VEGF-C、nm23和內(nèi)皮細(xì)胞CD105表達(dá)，與局部血管生成及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院1992～2006年行手術(shù)切除治療的口腔鱗癌患者的存檔蠟塊68例，標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)。所有患者術(shù)前均未接受放化療及免疫治療，均有完整的臨床病理資料。年齡23～74(平均41.35)歲。有頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者28例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例。另選擇正?？谇火つ?biāo)本16例作為對(duì)照。

1.2 試劑與方法 試劑:兔抗人VEGF-C多克隆抗體、鼠抗人nm23單克隆抗體和鼠抗人CD105單克隆抗體(均為工作液)SP免疫組化超敏染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑等均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。3氨基-9-乙基-卡唑(AEC)染色劑購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。采用免疫組織化學(xué)SP法，實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒說明。VEGF-C和nm23用DAB顯色，用試劑公司提供的陽性片作為陽性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替第一抗體作為陰性對(duì)照。CD105單克隆FITC標(biāo)記抗體采用美國(guó)B-D公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞術(shù)主要步驟:新鮮標(biāo)本用眼科剪刀粉碎后PBS漂洗，800 r/min離心3 min，2次，70%冷乙醇固定，4℃冰箱過夜，300目尼龍篩網(wǎng)過濾，再用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml。PBS洗去乙醇，加入FITC標(biāo)記的熒光抗體，4℃避光孵育30 min，PBS漂洗利用美國(guó)B-D公司生產(chǎn)的Facscalibur型流式細(xì)胞儀，以波長(zhǎng)635 nm、輸出功率為15 W的氬離子激光器作光源檢測(cè)分析10 000個(gè)細(xì)胞。

1.3 結(jié)果判定 VEGF-C和nm23均主要為胞質(zhì)著色，少數(shù)為胞核著色，以胞質(zhì)/胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽性染色細(xì)胞，判定標(biāo)準(zhǔn)為:以陽性細(xì)胞率＞25%為陽性表達(dá)(+)，陽性細(xì)胞率≤25%為陰性表達(dá)(－)。CD105陽性率:陽性細(xì)胞大于50%為陽性，小于20%為陰性，20% ～50%之間為可疑陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2、t檢驗(yàn)和等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 VEGF-C和nm23在口腔鱗癌和正常上皮中的表達(dá)VEGF-C、nm23在口腔鱗癌組織中的陽性表達(dá)率分別為52.94%和48.52%，前者明顯高于正常組織(30.27%)(P＜0.01)，而后者低于正常組織(66.95%)(P＜0.05)。

2.2 VEGF-C和nm23表達(dá)與口腔鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的口腔鱗癌組織中VEGF-C陽性表達(dá)率(79.82%)顯著高于無轉(zhuǎn)移的組織(25.69%)(P＜0.01)，而在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中nm23的表達(dá)(35.88%)明顯低于無轉(zhuǎn)移的組織(61.03%)(P＜0.05)。

2.3 CD105陽性率 CD105在正常上皮中呈現(xiàn)陰性表達(dá)，而在口腔鱗癌中呈現(xiàn)陽性表達(dá)(84.17%)，且腫瘤中央陽性率明顯高于腫瘤周邊(P＜0.01)。

2.4 VEGF-C和nm23表達(dá)與CD105陽性率的關(guān)系 VEGF-C陽性表達(dá)的口腔鱗癌CD105陽性率(91.22%)明顯高于其陰性表達(dá)組(77.29%)(P＜0.05)，且兩者之間存在密切相關(guān)(r=0.863 7，P＜0.01)，nm23陽、陰性表達(dá)的口腔鱗癌中CD105陽性率分別為74.17%和86.08%。差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，兩者之間不存在直線相關(guān)(r=－0.157 7，P＞0.05)。

2.5 VEGF-C和nm23表達(dá)的相關(guān)性分析 相關(guān)分析結(jié)果顯示，VEGF-C表達(dá)與 nm23表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=－0.525，P＜0.01)，即VEGF-C陽性表達(dá)率較高者nm23陽性表達(dá)率較低，VEGF-C陽性表達(dá)率較低者nm23陽性表達(dá)率則較高。

3 討論

腫瘤的浸潤(rùn)發(fā)展與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的臨床生物學(xué)特性之一，直接導(dǎo)致口腔鱗癌臨床分期滯后，甚至喪失手術(shù)機(jī)會(huì)，是影響口腔鱗癌預(yù)后的主要因素之一。近年來研究表明，腫瘤誘導(dǎo)的血管生成反應(yīng)與腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

VEGF-C為目前已知的作用最強(qiáng)的促血管生成因子，在腫瘤血管形成中起重要作用。VEGF-C是VEGF家族的新成員，它是一種針對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原，雙重轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)證明，VEGF-C能誘導(dǎo)淋巴管生成，并介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞播散和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移〔1～3〕。VEGF-C和受體VEGF-R3結(jié)合后，通過MEK/ERK和PI3激酶/Akt途徑引起淋巴管內(nèi)皮增生，并可能改變?cè)械暮托律牧馨凸軆?nèi)皮的通透性以及腫瘤細(xì)胞和胞外基質(zhì)的黏附性;同時(shí)淋巴管數(shù)目增多，使瘤細(xì)胞接觸淋巴管的機(jī)會(huì)增多，也促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。近年來發(fā)現(xiàn)VEGF-C及VEGF-R3與頭頸部腫瘤、胃癌、大腸癌、前列腺癌等惡性腫瘤的淋巴管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且是獨(dú)立的預(yù)后不良因素。本研究結(jié)果提示VEGF-C可能參與口腔鱗癌的發(fā)生過程。VEGF-C陽性表達(dá)率較高的口腔鱗癌組織有較強(qiáng)的侵襲和穿越淋巴管的能力，其陽性表達(dá)可能與口腔鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和進(jìn)展有關(guān)。

CD105基因位于人染色體9q34，其蛋白是一種同型二聚體的膜結(jié)合糖蛋白，分子量為180 kD，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體復(fù)合物的成分之一，其功能是參與血管生成。CD105是一種內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，僅在處于增殖狀態(tài)的腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞上而在正常的組織血管上無表達(dá)〔4～6〕。本實(shí)驗(yàn)提示VEGF-C在促進(jìn)口腔鱗癌微血管形成中起一定作用;同時(shí)，腫瘤中央部位微血管密度較高，而中央部位由于缺氧導(dǎo)致的壞死也比較嚴(yán)重，可能是刺激VEGF-C合成的主要因素，當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)到一定體積時(shí)，因宿主血管生成不足，而引起局部缺氧，從而刺激腫瘤細(xì)胞分泌VEGF-C，促進(jìn)新生血管生成，增加血管通透性。因此，VEGF-C一方面加速了腫瘤的生長(zhǎng)，另一方面促進(jìn)了腫瘤的轉(zhuǎn)移。

已知人類的nm23基因家族有8個(gè)成員，nm23基因編碼產(chǎn)物是核苷二磷酸激酶，它通過調(diào)節(jié)GTP的合成參與G蛋白調(diào)控的跨膜信息傳遞，從而對(duì)細(xì)胞的分化及癌基因的轉(zhuǎn)化起作用，此外研究顯示尚有激發(fā)管蛋白聚合的作用，因此具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的能力，與抑制腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的是 nm23-H1〔7～9〕。nm23-H1編碼一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為18×103的二磷酸核苷激酶，與腫瘤的遠(yuǎn)程轉(zhuǎn)移有關(guān)，其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制仍不清楚。nm23基因與口腔鱗癌的關(guān)系，目前這方面的研究較少，且得出的結(jié)果有很大的不一致性，有報(bào)道〔8〕認(rèn)為nm23基因只與宮頸腺癌的預(yù)后有關(guān)而與宮頸鱗癌無關(guān)。有學(xué)者〔9〕對(duì)乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌的研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中nm23表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，說明nm23基因在腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移過程中起重要的抑制作用。本研究提示nm23基因的失活與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。nm23基因突變、低表達(dá)具有促進(jìn)腫瘤發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的作用。nm23基因的表達(dá)對(duì)微血管生成及腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能具有協(xié)同作用。本研究提示nm23低表達(dá)可能促進(jìn)VEGF-C高表達(dá)，從而促使癌間質(zhì)血管新生，為腫瘤的浸潤(rùn)進(jìn)展提供氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì);在口腔鱗癌細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)移和臨床進(jìn)展過程中，VEGF-C與nm23之間可能具有相互誘導(dǎo)或信息傳遞的負(fù)調(diào)節(jié)作用。

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