孫林娟 徐勝利 周 明 毛麗君 陳 彪 (中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 0009)

目前帕金森病(PD)的治療以增加腦內(nèi)多巴胺(DA)濃度的替代治療為主，隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，藥物導(dǎo)致的副作用嚴(yán)重影響患者的治療。尋找具有多巴胺能神經(jīng)保護(hù)作用和增加腦內(nèi)DA濃度的藥物成為研究的熱點(diǎn)。半胱胺是美國(guó)食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)應(yīng)用于胱氨酸病的藥物，是細(xì)胞內(nèi)正常存在的成分。研究證明，半胱胺具有抑制脂質(zhì)過氧化、蛋白羰基化作用，提高超氧歧化酶活性、谷胱甘肽和過氧化氫酶的活性，促進(jìn)細(xì)胞巰基儲(chǔ)存和自由基清除〔1〕。半胱胺在亨廷頓病(HD)動(dòng)物模型中具有保護(hù)DA能神經(jīng)元的作用，已經(jīng)應(yīng)用于HD臨床研究〔2〕。但半胱胺在PD中的研究未見報(bào)道，并且半胱胺的神經(jīng)保護(hù)作用劑量報(bào)道不一。本研究旨在探討半胱胺在PD動(dòng)物模型中的效果，為半胱胺在PD中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 DA、MPTP、酪氨酸羥化酶(TH)單克隆抗體均購(gòu)自Sigma-Aldrich;HClO4及配制流動(dòng)相所用試劑均為色譜級(jí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備 取78只SPF級(jí)6～8周齡C57BL小鼠(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重20～23 g。每籠5只，自由攝食、飲水;照明:黑暗時(shí)間為12 h:12 h。所有實(shí)驗(yàn)程序均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指南(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的出版物第80-23號(hào)，1996年修訂);我們使用能獲得有效實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的最少動(dòng)物，盡量減輕動(dòng)物的痛苦。給予小鼠腹腔注射0.9%生理鹽水新鮮配制的 MPTP-HCl(20 mg/kg)，共5 d，首先2次/d×2 d，間隔12 h，繼之1次/d×3 d。分組為:(1)對(duì)照組;(2)MPTP模型組;半胱胺預(yù)防組:(3)半胱胺20 mg/kg+MPTP組、(4)半胱胺75 mg/kg+MPTP組;半胱胺治療組:(5)MPTP+半胱胺20 mg/kg組、(6)MPTP+半胱胺75 mg/kg組。半胱胺預(yù)防性給藥分2個(gè)劑量組(半胱胺20 mg/kg，75 mg/kg)，半胱胺2次/d×4 d，第5天起同時(shí)給以MPTP;半胱胺治療性用藥與MPTP同天給藥;總療程14 d。

1.3 紋狀體樣品制備 末次藥物注射后24 h，動(dòng)物斷頭處死后，立即分離紋狀體，自皮質(zhì)前端與大腦中線交點(diǎn)向后1.7～3.5 mm區(qū)域與中線旁0.8～3.3 mm區(qū)域?yàn)殡p側(cè)紋狀體〔3〕，剝離皮層，將組織放入已經(jīng)編號(hào)的一次性加蓋塑料管中，投入液氮中保存。標(biāo)本收集完畢后，轉(zhuǎn)入－80℃冰箱保存。稱重量后，每15 mg組織加入1 ml 0.4 mol/L HClO4，冰浴中超聲破碎組織，功率200 W、超聲2 s、間隔2 s，共5次;12 000 r/min 4℃離心12 min;離心2次，取上清待用;沉淀加入1 ml 0.5 mol/L NaOH，存放于－20℃，Lowry法檢測(cè)其中的蛋白含量。

1.4 反向高效液相色譜-電化學(xué)(HPLC-ECD)檢測(cè)器測(cè)定紋狀體DA含量 色譜柱為ZORBAX SB-C18柱，4.6 mm×150 mm，粒徑5 μm;流動(dòng)相(新鮮配制并經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾)為0.035 mol/L無(wú)水枸櫞酸;0.09mol/L無(wú)水醋酸鈉，0.23 mmol/L辛烷基磺酸鈉(SOS，Sigma公司);0.13 mmol/L乙二胺四乙酸，10%甲醇，pH4.7，流量1.0 ml/min，檢測(cè)器工作電位0.50 V，靈敏度5 nA。配置不同濃度的DA標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度2～1 000 μg/L，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣品以20 μl進(jìn)樣，根據(jù)色譜峰面積進(jìn)行定量。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 末次注射半胱胺后24 h，用水合氯醛(100 mg/kg)深度麻醉小鼠后迅速開胸暴露心臟，剪開右心耳，經(jīng)左心室快速灌注冰生理鹽水50 ml和4%多聚甲醛100 ml。斷頭取出全腦，在上述固定液中后固定24 h，再依次放入30%的蔗糖溶液中，待腦組織下沉后修整中腦組織塊，在冰凍切片機(jī)上進(jìn)行冠狀連續(xù)冰凍切片，片厚30 μm。切片放入0.01 mol/L PBS中進(jìn)行漂片處理。切片的染色過程嚴(yán)格按ABC試劑盒說明書操作，過程包括:PBS漂洗5次，0.3%Triton-PBS 30 min，3%H2O230 min，PBS 漂洗 3 次，5%羊血清封閉30 min，在含1%胎牛血清、0.3%Triton的PBS液中加入兔抗酪氨酸羥化酶一抗(1∶10 000)，4℃冰箱中過夜;PBS漂洗3次，加入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶500)孵育2 h，PBS漂洗3次，加入HRP三抗工作液(1∶500);DAB顯色。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。TH染色陽(yáng)性的神經(jīng)元計(jì)數(shù)方法:應(yīng)用裝載NIS-Elements成像軟件的Nikon顯微鏡計(jì)數(shù)。每張切片雙側(cè)計(jì)數(shù)兩遍，取平均數(shù)作為該張切片的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)數(shù)各組的細(xì)胞數(shù)再取平均數(shù)，結(jié)果以各組神經(jīng)元數(shù)量占對(duì)照組的%表示。

2 結(jié)果

2.1 MPTP對(duì)小鼠紋狀體DA水平和黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元的影響 MPTP組紋狀體DA水平比正常組下降了55%(26.38±6.47 vs 57.62±12.70，P＜0.01)。MPTP導(dǎo)致模型組TH陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目為對(duì)照組的56.37%(166.65±38.14 vs 295.65±47.46，P ＜0.01)。

2.2 半胱胺對(duì)MPTP模型小鼠紋狀體DA水平的影響 半胱胺(20 mg/kg)預(yù)處理4 d再給予MPTP組有效地預(yù)防MPTP導(dǎo)致的多巴胺降低(47.96±10.57，P＜0.01);半胱胺(20 mg/kg)治療組、半胱胺(75 mg/kg)預(yù)防和治療組的多巴胺含量與MPTP模型組比較均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(36.27±16.42，25.65±7.71，25.08 ±8.10，P ＞0.05)。

2.3 半胱胺對(duì)MPTP模型小鼠黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元的影響半胱胺(20 mg/kg)預(yù)處理4 d再給予MPTP組有效地預(yù)防MPTP導(dǎo)致的TH陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目降低(267.45±34.01，P＜0.01)。半胱胺(20 mg/kg)治療組、半胱胺(75 mg/kg)預(yù)防和治療組的TH陽(yáng)性神經(jīng)元與MPTP模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(179.55 ±38.11，172.10 ±32.68，174.05 ±35.77，P ＞0.05)。

3 討論

PD臨床癥狀的產(chǎn)生是由于黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的退變和DA含量的減少。既有神經(jīng)保護(hù)作用同時(shí)又能提高神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺水平的藥物是治療PD理想和有效的藥物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，我們證明半胱胺在20 mg/kg低劑量時(shí)可以保護(hù)MPTP導(dǎo)致的C57小鼠黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元和紋狀體DA的丟失，與Tremblay等〔4〕報(bào)道的結(jié)果一致。

早期關(guān)于半胱胺的報(bào)道是給以C57小鼠半胱胺治療后，半胱胺導(dǎo)致了劑量依賴性的紋狀體DA濃度的增高。我們的實(shí)驗(yàn)顯示僅僅在低劑量(20 mg/kg)時(shí)產(chǎn)生了保護(hù)作用，相對(duì)高劑量(75 mg/kg)沒有顯示神經(jīng)保護(hù)作用。結(jié)果的不同也許來自于不同的給藥方法和不同的給藥頻率和時(shí)間。在Oishi等〔5〕的研究中，半胱胺給以的劑量明顯高于本次實(shí)驗(yàn)，但是半胱胺是在MPTP給藥前30 min單次給予200 mg/kg。而在本次實(shí)驗(yàn)中我們給以小鼠半胱胺治療14 d，明顯長(zhǎng)于以前的實(shí)驗(yàn)，半胱胺的總劑量在低和高劑量組分別達(dá)到了280 mg/kg和1 050 mg/kg，兩者都高于以前的報(bào)道。因此，由高劑量的半胱胺導(dǎo)致的毒性作用也許反映了半胱胺的累積效應(yīng)，半胱胺劑量效應(yīng)對(duì)于神經(jīng)功能的毒性作用也在HD小鼠模型中報(bào)道，在半胱胺的劑量達(dá)到600 mg/kg時(shí)產(chǎn)生了明顯的認(rèn)知功能的損害。Vecsei等〔6〕報(bào)道，在給予半胱胺后在不同腦區(qū)幾乎都導(dǎo)致了去甲腎上腺素的丟失，但是DA的變化是選擇性和雙向性的。CS在低劑量時(shí)具有神經(jīng)保護(hù)，而在高劑量則有毒性作用，表明了神經(jīng)保護(hù)劑的雙向作用效應(yīng)〔7〕。盡管超劑量怎樣導(dǎo)致神經(jīng)毒性還是不清楚，這觀察到的毒性仍然值得我們注意，在以后的實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)研究中半胱胺的劑量和給藥時(shí)間都應(yīng)該是被考慮的因素。綜上所述，半胱胺可以保護(hù)由MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型的DA能神經(jīng)元的毒性，并且保護(hù)作用與給藥的劑量和時(shí)間密切相關(guān)。在臨床其他疾病中的有效性和安全性將使半胱胺在以后治療包括PD在內(nèi)的神經(jīng)退行性變疾病中成為有效的治療策略。

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