蔣 月，盛鵬飛，張 陸

空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）是彎曲桿菌屬的一種，屬革蘭氏陰性菌，是一種人獸共患病原體。該菌可以引起家畜流產(chǎn)不孕、乳房炎及幼畜禽腹瀉和家禽肝炎。人類(lèi)主要通過(guò)食用受到污染的動(dòng)物產(chǎn)品、未經(jīng)煮熟的禽肉和生牛奶等感染［1］，從而引起人的急性腸炎和食物中毒，并伴發(fā)反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、肝炎和格林－巴利綜合癥等免疫性損傷性疾?。?］。近年來(lái)，空腸彎曲桿菌感染率在世界各地普遍呈上升趨勢(shì)。在發(fā)達(dá)國(guó)家，空腸彎曲菌在腹瀉病人中的分離率已超過(guò)了沙門(mén)氏菌和志賀氏菌。而在中國(guó)，空腸彎曲桿菌也是主要的腹瀉病原菌之一［3］。大多數(shù)空腸彎曲桿菌腸炎是自限性感染，臨床癥狀較輕的彎曲桿菌腸炎病例并不需要抗生素治療，但是嚴(yán)重的感染和被拖延了的腸炎病例、敗血癥都需要抗生素治療［4］，同時(shí)由于集約化養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，大量的抗生素尤其是氟喹諾酮類(lèi)和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物也被應(yīng)用到生產(chǎn)中，導(dǎo)致了日益嚴(yán)重的耐藥性問(wèn)題。本文就空腸彎曲桿菌對(duì)喹諾酮類(lèi)和大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)藥物的耐藥性機(jī)制研究進(jìn)展做一綜述。

1 空腸彎曲桿菌對(duì)喹諾酮藥物耐藥性產(chǎn)生的機(jī)理

1．1 喹諾酮類(lèi)藥物的作用靶位及抗菌機(jī)制 DNA回旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶是氟喹諾酮類(lèi)藥物作用于細(xì)菌的首要和次要靶位。DNA回旋酶是由2個(gè)A亞基（即GyrA）和2個(gè)B亞基（即GyrB）組成的四聚體，是一種與DNA復(fù)制整合及轉(zhuǎn)錄表達(dá)有關(guān)的Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶。A亞基由gyrA基因編碼，可以切斷、再結(jié)合和超螺旋化DNA鏈，而B(niǎo)亞基由gyrB基因編碼，含ATP水解功能區(qū)，可促進(jìn)ATP水解，為A亞基松解超螺旋供能。喹諾酮類(lèi)藥物是DNA回旋酶A亞單位的抑制劑，通過(guò)形成藥物－DNA－酶復(fù)合物而抑制DNA回旋酶的活性，阻礙DNA復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)菌死亡［2］。

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ亦為四聚體，由2個(gè)C亞單位（即ParC）和2個(gè)E亞單位（即ParE）組成，在DNA復(fù)制后期姐妹染色單體分離過(guò)程中起重要作用。C亞基由parC基因編碼，負(fù)責(zé)DNA斷裂和重接；E亞基由parE基因編碼，催化ATP水解。編碼gyrA、gyrB、ParC和ParE這些靶酶的基因的核苷酸順序以及這些酶的氨基酸順序都具有很大的相似性，parC基因、parE基因分別與DNA回旋酶gyrA基因、gyrB基因有同源性［2］。

1．2 空腸彎曲桿菌對(duì)喹諾酮藥物耐藥性產(chǎn)生的機(jī)理 隨著環(huán)丙沙星、諾氟沙星等喹諾酮類(lèi)抗生素在人醫(yī)和獸醫(yī)臨床上的大量使用，包括空腸彎曲桿菌在內(nèi)的許多病原菌對(duì)此類(lèi)藥物都產(chǎn)生了耐藥性，而彎曲桿菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制主要是如下兩點(diǎn)：藥物作用的靶位改變和外排泵引起的胞內(nèi)藥物聚集量降低。

1．2．1 藥物作用的靶位改變 在編碼DNA回旋酶的gyrA基因和編碼DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的parC基因內(nèi)有一個(gè)被稱(chēng)之為熱點(diǎn)的喹諾酮類(lèi)耐藥決定區(qū)（QRDR）［2］?？漳c彎曲桿菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的抗性主要是由于gyrA基因的QRDR區(qū)發(fā)生了數(shù)處點(diǎn)突變。gyrA基因上的突變可發(fā)生在多個(gè)不同的位點(diǎn)，也可以在同一位點(diǎn)。

以往研究學(xué)者對(duì)空腸彎曲桿菌螺旋酶gryA突變位點(diǎn)的報(bào)道如下：Drlica等（1997）認(rèn)為彎曲桿菌在gyrA第125位的酪氨酸（Tyr）殘基是催化DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合的位點(diǎn)，它的突變會(huì)造成彎曲桿菌對(duì)喹諾酮的耐藥作用。Husmann（1997）等發(fā)現(xiàn)彎曲桿菌gyrA在86位發(fā)生的蘇氨酸到異亮氨酸（Thr86Ile）的突變是導(dǎo)致彎曲桿菌喹諾酮耐藥主要的突變位點(diǎn)。同樣位置的突變也在Gerald（1999）等人的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)。Wang（1993）等人還報(bào)道了彎曲桿菌gyrA基因在90位發(fā)生的天冬氨酸到天冬酰氨（Asp90Asn），70位丙氨酸 Ala到蘇氨酸（Ala70Thr）的突變也是造成彎曲桿菌對(duì)喹諾酮藥物耐藥的原因。Ruiz（1998）等人還在臨床腸炎病人的身上分離到gyrA基因在86位發(fā)生蘇氨酸到賴(lài)氨酸（Thr86Lys）突變的彎曲桿菌，其環(huán)丙沙星的最小抑菌濃度（MIC）≥16mg／ml，萘啶酮酸的MIC≥128mg／mL［2］。Asp90Asn和 Thr86Lys的突變與中度耐藥（MIC＝8～16μg／mL）有關(guān)，還有一些以較低頻率出現(xiàn)的突變?nèi)纾篢hr86Ala、Thr86Val和Asp90Tyr突變，其中Thr86Ala突變時(shí)，彎曲桿菌對(duì)環(huán)丙沙星的 MIC為2μg／mL［5］。

盡管有這么gyrA多位點(diǎn)的突變，彎曲桿菌對(duì)喹諾酮的耐藥機(jī)制中最重要最常見(jiàn)的是gyrA基因發(fā)生的 Thr－86－Ile突變［6］。Bolton在對(duì)環(huán)丙沙星及萘啶酸高度耐藥（MIC＞32μg／mL或 MIC＞256 μg／mL）的空腸彎曲桿菌中發(fā)現(xiàn)了gryA的Thr－86－Ile和Asp－203－Ser突變，但并不是所有的高度耐藥菌株都有以上兩種突變，有些沒(méi)有Thr－86－Ile的突變的高耐菌株有兩株含有Asp－203－Ser突變，也有的菌株既沒(méi)有 Thr－86－Ile也沒(méi)有 Asp－203－Ser的突變［4］。 另 外 Ruiz 也 有 Thr86Ile－Pro104Ser 和Thr86Ile－Asp90Asn雙突變導(dǎo)致兩個(gè)氨基酸改變的報(bào)道，Thr86Ile－Asp90Asn雙突變會(huì)導(dǎo)致彎曲桿菌對(duì)第三代喹諾酮類(lèi)藥物莫西沙星出現(xiàn)更強(qiáng)的耐藥性，而單獨(dú)的Thr86Ile突變后，彎曲桿菌對(duì)這種第三代喹諾酮類(lèi)藥物還是敏感的［7］。也許還有沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)的機(jī)制對(duì)空腸彎曲桿菌高氟喹諾酮類(lèi)耐藥有重要的作用?？梢?jiàn)關(guān)于gyrA基因位點(diǎn)突變及其對(duì)高氟喹諾酮類(lèi)耐藥還需要進(jìn)一步研究。

目前還未見(jiàn)關(guān)于彎曲桿菌gryB突變的報(bào)道，Wang等對(duì)13株分離于雞的空腸彎曲桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)突變也未見(jiàn)gryB突變的的菌株［6］。關(guān)于彎曲桿菌屬DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶靶位parC基因變化與抗性相關(guān)的報(bào)道也十分鮮見(jiàn)，僅見(jiàn)1998年的一個(gè)報(bào)道，指出其突變位置在Arg－139上。隨后也有許多實(shí)驗(yàn)想擴(kuò)增parC，但是都失敗了，因此Payot認(rèn)為空腸彎曲桿菌中可能沒(méi)有parC基因，喹諾酮藥物主要通過(guò)DNA回旋酶起作用，而較少與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶發(fā)生作用，單獨(dú)的DNA回旋酶gryA亞基的改變（如Thr86Ile）足以導(dǎo)致彎曲桿菌對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥表型［5］。關(guān)于喹諾酮類(lèi)耐藥決定區(qū)的研究還在不斷的深入，隨著更多的突變位點(diǎn)被確定，我們將對(duì)喹諾酮耐藥的機(jī)理有一個(gè)更深刻的認(rèn)識(shí)。

1．2．2 外排泵引起的胞內(nèi)藥物聚集量降低 Cme－ABC外排泵是空腸彎曲桿菌首要的外排泵系統(tǒng)，這個(gè)外排泵廣泛存在于彎曲桿菌屬細(xì)菌內(nèi)，可以介導(dǎo)對(duì)包括氟喹諾酮類(lèi)、紅霉素、氨芐西林、四環(huán)素和氯霉素等多種抗生素的固有耐藥性［8］。多藥外排泵CmeABC也可以與gryA突變協(xié)同介導(dǎo)空腸彎曲桿菌對(duì)氟喹諾酮的高水平耐藥性［5］。CmeABC外排泵由外膜蛋白CmeC和內(nèi)膜RND轉(zhuǎn)運(yùn)家族蛋白cmeB和胞質(zhì)融合蛋白CmeA組成［4］。CmeB蛋白在結(jié)構(gòu)上和功能上都與其他革蘭氏陰性細(xì)菌RND超家族的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相似。Kurincic經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CmeABC外排泵的轉(zhuǎn)錄成分cmeB基因被滅活后，CmeABC外排泵也會(huì)失活［9］，Payot檢測(cè)了多重耐藥空腸彎曲桿菌中cmeB的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)這些菌株的cmeB基因高表達(dá)，且菌株內(nèi)環(huán)丙沙星的聚集量下降［5］。Pumbwe也測(cè)試了多重耐藥空腸彎曲桿菌中cmeB基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)1／3的菌株都高表達(dá)cmeB基因，這些菌株內(nèi)積聚的環(huán)丙沙星也較少［10］，這些都提示了CmeABC外排泵與空腸彎曲桿菌喹諾酮類(lèi)藥物耐藥性之間的關(guān)系。

Lin等描述了CmeABC外排泵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑cmeR，cmeR位于cmeABC操縱子的啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)，它是一個(gè)高度保守的TetR樣的抑制劑，在空腸彎曲桿菌中的CmeR插入突變導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)環(huán)丙沙星有更高耐藥性，這和CmeABC的高表達(dá)有關(guān)［11］。Pumbwe檢測(cè)多重耐藥空腸彎曲桿菌也包含CmeR抑制物的Gly86Ala突變，另外也有cmeR基因的Gln9Pro突變，但是他們的具體功能還不是很清楚［10］。

CmeDEF是空腸彎曲桿菌的第二個(gè)外排泵，cmeF基因編碼了此外排泵的RND型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［11］。盡管CmeDEF基因轉(zhuǎn)錄，但其表達(dá)水平還是顯著低于CmeABC［5］。Pumbwe調(diào)查了多重耐藥空腸彎曲菌CmeDEF的表達(dá)，結(jié)果顯示一部分細(xì)菌同時(shí)高表達(dá)cmeB和cmeF基因，但是沒(méi)有菌株單獨(dú)高表達(dá)cmeF基因［10］。隨后Pumbwe等又證明一個(gè)外排泵可能對(duì)另一個(gè)外排泵有影響作用［12］。也有報(bào)道cmeF的突變并沒(méi)有改變其對(duì)環(huán)丙沙星、紅霉素、四環(huán)素和氯霉素的敏感性［9，13］。

在彎曲桿菌基因序列中還有許多編碼其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族（如 MFS、SMR、ABC和 MATE）假定外排泵的基因［5］。Ge等試驗(yàn)使包括cmeB和cmeF的8種假定外排泵基因失活，發(fā)現(xiàn)除了cmeB，其他外排泵基因失活不會(huì)影響空腸彎曲菌對(duì)氯霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素和四環(huán)素的敏感性［13］。由以上結(jié)果可見(jiàn)這些假定外排泵系統(tǒng)在空腸彎曲桿菌多重耐藥性中的作用還需要進(jìn)一步的研究。

2 空腸彎曲桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制

2．1 大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)藥物作用靶位及抗菌機(jī)制 蛋白質(zhì)的合成是通過(guò)核糖體的催化進(jìn)行的，細(xì)菌核糖體為70S核糖體，它由兩個(gè)亞單位組成，分別為30S和50S。30S亞單位結(jié)合信使RNA（mRNA）并啟動(dòng)核糖體循環(huán)；50S亞基235rRNA上含有膚酞轉(zhuǎn)移酶中心，能催化肽鍵的形成，把氨基酸連接到不斷延伸的膚鏈上合成蛋白質(zhì)。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物是抑菌類(lèi)抗生素，主要是通過(guò)結(jié)合細(xì)菌核糖體50S亞基的23SrRNA引起肽酰tRNA的溶解進(jìn)而干擾蛋白質(zhì)合成來(lái)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。

2．2 大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制 空腸彎曲桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制主要是抗生素靶位突變和外排泵導(dǎo)致的抗生素外流［4］。

2．2．1 抗生素靶位突變 細(xì)菌核糖體50S亞基中的23SrRNA區(qū)域是大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)藥物的主要靶點(diǎn)，這個(gè)靶位的突變將會(huì)阻止大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)藥物與細(xì)菌的結(jié)合繼而出現(xiàn)耐藥［14］。抗生素靶位突變也是空腸彎曲桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物耐藥的最常見(jiàn)機(jī)制?？漳c彎曲桿菌23SrRNA基因V區(qū)的2074和2075位置（等同于大腸桿菌的2058和2059位置）的核苷酸突變（A2075G、A2074C或A2074T）導(dǎo)致其對(duì)紅霉素 等 大 環(huán) 內(nèi) 酯 類(lèi) 的 高 水 平 耐 藥 性［9，15－16］。 其 中23SrRNA基因V區(qū)的2075位置的突變是其高度耐藥最常見(jiàn)的機(jī)制，這個(gè)機(jī)制也在肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌等其他菌株中出現(xiàn)［17］。而23SrRNA基因V區(qū)的2074位置核苷酸的突變較少報(bào)道，Vacher等描述了同一株菌23S rRNA的2074位置發(fā)生了顛換突變同時(shí)發(fā)生了A2074C／A2075G的雙重突變，他認(rèn)為A2074T介導(dǎo)的是低水平的耐藥，而且并不出現(xiàn)在所有的23S rRNA基因上［18］。Gibreel等報(bào)道了一株空腸彎曲桿菌的A2074G突變與紅霉素的高水平耐藥（MIC＝512μg／mL）有關(guān)，但是經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代的A2074G的突變株沒(méi)有A2075G突變株穩(wěn)定［19］。

為了防止革蘭氏陽(yáng)性菌對(duì)大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)藥物的抗性，發(fā)展出了一種新的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物，酮內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥，例如泰利霉素就會(huì)對(duì)許多耐大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的鏈球菌有效［5］。Mamelli和Cagliero也報(bào)道，對(duì)紅霉素等大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥的彎曲桿菌菌株會(huì)影響其對(duì)泰利菌素的敏感性，在有23SrRNA突變的菌株，MIC可從32到變化到＞128mg／mL［8，20］。而核糖體突變菌株對(duì)泰利霉素的親和性比野生型的敏感株低［20］。

核蛋白L4和L22被認(rèn)為是合成細(xì)菌70S核蛋白多肽排出通道的組成部分［21］。rplD和rplV為編碼核蛋白L4和L22的基因［17］，他們的突變也會(huì)影響肽的合成及藥物與細(xì)菌的結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致了彎曲桿菌對(duì)紅霉素高水平耐藥。在彎曲桿菌rplD主要有 以 下 3 種 突 變：Gly57Ala，Gly57Val和Gly74Ala［22－23］。對(duì)于rplV，在 L22的86或98位有3個(gè)或4個(gè)氨基酸的插入會(huì)導(dǎo)致大環(huán)內(nèi)脂的耐藥［22］。Corcoran描述了13株有特征性A2075G突變的彎曲桿菌中伴隨著L4蛋白和L22蛋白中有一個(gè)或多的氨基酸替換，有時(shí)這種替換會(huì)和結(jié)構(gòu)內(nèi)6個(gè)連續(xù)氨基酸的插入或缺失有關(guān)［24］。另外不是所有核糖體蛋白L4和L22的突變都會(huì)導(dǎo)致紅霉素的耐藥性的改變，如L22蛋白的A103V堿基替換會(huì)導(dǎo)致空腸彎曲桿菌對(duì)紅霉素的高水平耐藥，但是L22蛋白的K15I、E111A、T114A和V121A，L4的V196A突變就不會(huì)對(duì)彎曲桿菌抗生素敏感性產(chǎn)生影響，因?yàn)樗鼈儾辉谂c抗生素敏感性有關(guān)的區(qū)域內(nèi)［4］。當(dāng)然關(guān)于突變導(dǎo)致的大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)耐藥作用還需要進(jìn)一步研究。

2．2．2 大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)的外排泵 與GyrA亞單位中Thr86Ile修飾和CmeABC外排泵協(xié)同介導(dǎo)的氟喹諾酮類(lèi)耐藥性相似，CmeABC外排泵和23SrRNA基因突變可共同介導(dǎo)對(duì)彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥的高水平耐藥［8，25］。CmeABC外排泵與細(xì)菌固有和獲得性的抗性有關(guān)，其排出的抗生素除了氟喹諾酮類(lèi)藥性也包括大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥。Payot對(duì)禽和豬的耐喹諾酮和紅霉素彎曲桿菌進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)對(duì)RND轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白特異的外排泵抑制劑（EPI）PaβN可恢復(fù)低水平耐藥（MIC＝8～16μg／mL）的菌株對(duì)紅霉素的敏感性，但它不能恢復(fù)有23SrRNA突變的紅霉素高水平耐藥（MIC≥512μg／mL）菌株對(duì)紅霉素的敏感性［26］。Kurincic也表明PaβN能恢復(fù)低耐藥菌株對(duì)紅霉素的敏感性，至少16～32倍提升高水平耐藥彎曲桿菌對(duì)紅霉素的敏感性［15］。這些結(jié)果都證明了CmeABC外排泵在彎曲桿菌固有紅霉素耐藥性和獲得低水平紅霉素耐藥性中的作用。

Cagliero等對(duì)人源、禽源和豬源的對(duì)紅霉素呈不同耐藥的彎曲桿菌進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果編碼CmeABC外排泵的轉(zhuǎn)錄成分cmeB基因被滅活后，CmeABC外排泵的失活會(huì)恢復(fù)無(wú)23SrRNA基因突變的低、中度紅霉素耐藥彎曲桿菌的敏感性，Mamelli等的試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了同樣的發(fā)現(xiàn)。而在有23SrRNA基因突變的高度紅霉素耐藥彎曲桿菌中，cmeB基因滅活后，紅霉素的MIC降低了128至256倍。彎曲桿菌大的此外排泵機(jī)制對(duì)酮內(nèi)酯和泰利霉素也有效，相反，阿奇霉素受外排泵的影響較?。?，20］。

Hanninen報(bào)道CmeR會(huì)抑制CmbABC的轉(zhuǎn)錄，CmeR抑制位點(diǎn)的突變會(huì)導(dǎo)致外排泵的過(guò)表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)了對(duì)許多抗生素的抗性［27］，Lin也指出cmeR突變株和體外環(huán)丙沙星誘導(dǎo)后的選擇株都表現(xiàn)出包括紅霉素的多重耐藥性［11］。Pumbwe等也發(fā)現(xiàn)人和禽源的多重耐藥菌有同樣的模式［10］。這些結(jié)果顯示了cmeR與空腸彎曲桿菌的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥可能的關(guān)系。

CmeABC外排泵也可能有CmeEDF和外排泵其他的外排泵的共同作用并在減少大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物敏感性起著重要的作用，這還需要進(jìn)一步的研究。

3 結(jié) 語(yǔ)

空腸彎曲桿菌中最常見(jiàn)的氟喹諾酮類(lèi)和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥機(jī)制是gyrA基因和23SrRNA基因的突變，然而CmeABC外排泵也可協(xié)同介導(dǎo)高水平的氟喹諾酮類(lèi)和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥。外排泵的高表達(dá)可以導(dǎo)致彎曲桿菌的多重耐藥并在彎曲桿菌的耐藥中起著重要作用。當(dāng)然其他的靶位突變和外排泵系統(tǒng)也需要進(jìn)一步的研究。了解空腸彎曲桿菌對(duì)氟喹諾酮類(lèi)和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的有關(guān)的機(jī)制，不但能夠?yàn)橛盟幾鞒鲋笇?dǎo)，還可以為耐藥彎曲桿菌的防控作出重要貢獻(xiàn)。

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