常 城 何仁勝 劉少平

（湖北省黃石市中心醫(yī)院，湖北 黃石 435000）

斑蝥是我國的傳統(tǒng)中藥，有效成分—斑蝥素（CA）對多種腫瘤細胞的生長有抑制作用。臨床主要用于治療肺癌、食管癌及胃癌等，并有獨特的升高白細胞作用。但因其具有強烈的泌尿系統(tǒng)和消化系統(tǒng)刺激作用，不易為患者接受。近年來研究表明，去甲斑蝥素（NCTD）對體外培養(yǎng)的多種消化道腫瘤細胞均有明顯的殺傷作用，具有良好的抗腫瘤作用，其機制可能與干擾腫瘤細胞生長周期，抑制DNA的合成代謝，影響細胞的有絲分裂，誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)。除此以外，NCTD 還具有抗腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力。本文現(xiàn)將近年來NCTD 抗腫瘤的作用機制及臨床應(yīng)用前景研究概述如下。

1 構(gòu)效關(guān)系

NCTD 是由呋喃及順丁烯二酸酐通過Diels-Alder反應(yīng)合成制得，與CA 構(gòu)型相同，唯1，2 位無甲基。去除斑蝥素的兩個甲基后，泌尿系刺激基本消失，升白效果更明顯，說明該結(jié)構(gòu)中兩個甲基是泌尿系刺激的主要功能團，對抗腫瘤及升白的影響則小。有實驗表明CA 和NCTD 在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡方面有相似的特性。

2 NCTD 抗消化道腫瘤的作用機制研究

2.1 抑制腫瘤細胞的增殖、促進腫瘤細胞凋亡 腫瘤是細胞增生失控引起的。正常細胞增殖與凋亡處于一個平衡狀態(tài)，若細胞增殖超過凋亡，則表現(xiàn)出生長優(yōu)勢，這是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要基礎(chǔ)。李功權(quán)等［1］采用Annexin V 和PI 雙染和流式細胞儀法進行凋亡檢測。該實驗本實驗應(yīng)用NCTD 10 μg/mL 處理肝癌細胞12 h后收集細胞進行凋亡檢測。結(jié)果顯示NCTD 處理可使27%的SMMC-7721的細胞發(fā)生凋亡，明顯高于對照組（NCTD 10 μg/mL）的凋亡率7%。NCTD 處理可使30%的BEL-7402的細胞發(fā)生凋亡，也明顯高于對照組的凋亡率8%，表明NCTD 對此兩株肝癌細胞均有較強的誘導(dǎo)凋亡作用。

2.2 阻滯腫瘤細胞的細胞周期 研究表明，惡性腫瘤的無限制增殖與細胞增殖周期的失控有關(guān)，細胞周期的失控與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。大量的研究發(fā)現(xiàn)，NCTD 可作用于細胞周期的不同時期，使細胞周期阻滯、分裂受阻從而導(dǎo)致細胞凋亡。目前公認的細胞周期調(diào)控模式是細胞周期在多個調(diào)控點上受到調(diào)節(jié)。其中有3個調(diào)控點最為重要，G1/S 期，G2/M 期和有絲分裂中期、后期的交界處。在這些調(diào)控點上的失控就很容易導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。到目前為止，已有3 類細胞周期調(diào)控因子被發(fā)現(xiàn)：細胞周期素（cyclin）、細胞周期素依賴性蛋白激酶（CDK）和細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制物（CDKI）。Fan 等［2］將GBC-SD 細胞分為NCTD 組合對照組。MTT 法測定細胞抑制率、流式細胞儀測定細胞周期和凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NCTD 能抑制細胞的增值，48 h半數(shù)致死量為56.18 μg/mL。NCTD 作用功細胞48 h后，流式細胞儀觀察發(fā)現(xiàn)：G2/M 期細胞明顯增多，而S期細胞明顯減少。為進一步了解NCTD 阻滯GBC-SD細胞周期的機制，作者用RT-PCR 法檢測細胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1、p27、Cip/Kip的表達，結(jié)果提示cyclin D1、p27 mRNA 表達降低，而Cip/Kip 表達增高。結(jié)果表明，NCTD 可能是通過降低增殖相關(guān)基因cyclin D1、p27 表達和上調(diào)抑癌基因Cip/Kip的表達，通過細胞周期調(diào)控達到抑制腫瘤細胞增殖的作用。

2.3 抑制細胞DNA 及蛋白質(zhì)的合成 DNA 復(fù)制起始蛋白是真核細胞起始DNA 復(fù)制所必須的調(diào)控因子，包括Cdc6、Orc、Cdtl 和Mcm2-7，其中Cdc6 蛋白具有癌基因功能，可促進細胞的惡性轉(zhuǎn)化，通過抑制Cdc6 可產(chǎn)生抗腫瘤作用，Cdc6 已被證實可作為有效的抗腫瘤靶點。李金龍等［3］用BrdU 滲入法檢測NCTD 對HeLa細胞DNA 復(fù)制的變化。結(jié)果顯示：作用細胞12 h 后，BrdU 滲入受到明顯抑制，表明NCTD 可抑制HeLa 細胞DNA 復(fù)制。同一實驗還觀察到NCTD 作用細胞24 h后，DNA 復(fù)制起始Cdc6 被降解成較小的片段。

2.4 對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 近年來，人們對凋亡的調(diào)控機制進行了深入的研究，并已取得一些可喜成果?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一些對細胞凋亡起重要調(diào)控作用的蛋白，如Bc1-2/Bax、Caspase、Cyto C 等，這些蛋白的表達異常會促使細胞惡性增殖并阻止細胞凋亡。Bcl-2 為凋亡抑制蛋白，而Bax 功能與之相反，可加速細胞凋亡的進展。Bcl-2 通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)細胞凋亡。當(dāng)Bax 形成同源二聚體時誘導(dǎo)細胞凋亡；Bax與Bcl-2 形成異源二聚體時則實現(xiàn)了Bcl-2 抑制細胞凋亡的功能。

Li 等［4］認為NCTD 誘導(dǎo)人肝癌細胞的凋亡與線粒體通路有關(guān)。他們選用人肝癌細胞SMMC-7721 進行常規(guī)培養(yǎng)，MTT 檢測細胞抑制率，流式細胞儀檢測細胞 凋 亡，Westren-Blot 檢 測Cyto C、Caspase C、Bax/Bcl-2、AIF 蛋白的表達。結(jié)果顯示NCTD 能夠抑制SMMC-7721 細胞的表達且成時間-劑量依賴性。NCTD作用細胞24 h 后，抑制凋亡的Bcl-2 蛋白表達減少，促凋亡蛋白Bax 表達增加，Cyto C、Caspase 3 表達增加。該結(jié)果提示NCTD 可能是通過誘導(dǎo)Bax 表達增加，使線粒體通透孔道（PT）開放，線粒體內(nèi)的蛋白Cyto C被釋放到細胞質(zhì)中，與細胞質(zhì)中的Apaf-1 及Caspase-9 前體形成凋亡小體活化Caspase-9，進一步活化Caspase 3 啟動Caspase 級聯(lián)，最終誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。

2.5 對腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響 臨床研究表明，許多癌癥患者最終死于腫瘤的全身轉(zhuǎn)移而不是原發(fā)病灶，究其原因主要是因為腫瘤細胞具有極強侵襲性，能突破正常細胞基底膜轉(zhuǎn)移到其他部位形成轉(zhuǎn)移灶。因此，抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡、阻止腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移便成為抗癌治療的基本原則。趨化因子能募集特定的細胞到特定的區(qū)域，如果腫瘤細胞的趨化因子持續(xù)高表達，就有可能增加癌細胞轉(zhuǎn)移的概率，研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4/CXCL12生物學(xué)軸與腫瘤的發(fā)生密切。當(dāng)CXCL12與CXCR4特異性結(jié)合后，便趨化相應(yīng)細胞到達相應(yīng)部位，從而發(fā)揮刺激腫瘤生長轉(zhuǎn)移、新生血管生成、抑制機體對腫瘤的免疫效應(yīng)等作用，最終形成轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤。徐小峰等［5］通過real time PCR 和Western Blot 法檢測發(fā)現(xiàn)，不同濃度的NCTD 對體外培養(yǎng)的MCF-7 細胞均具有抑制其CXCR4 mRNA 和蛋白表達的作用，且呈濃度依賴性。表明NCTD 具有抑制乳腺癌細胞遷移的作用，從而為NCTD的抗腫瘤臨床應(yīng)用進一步奠定了基礎(chǔ)。

3 臨床應(yīng)用

3.1 抑制腫瘤 近年來NCTD 在消化道腫瘤中的應(yīng)用越來越廣泛，主要原因是其能較好地抑制腫瘤生長，改善癥狀，延長生存期，提高機體免疫功能，并且具有較小的毒副作用。因此在臨床上的應(yīng)用也受到越來越多的關(guān)注。臨床實踐表明，使用NCTD 治療原發(fā)性肝癌可使患者食欲增加，腹脹、肝區(qū)疼痛減輕或消失，生存期明顯延長。簡光富等［6］采用NCTD 注射液肝內(nèi)瘤體中心注射治療原發(fā)性肝癌20例，完全緩解率10%（2例），中數(shù)緩解期1年6個月；部分緩解率60%（12例），中數(shù)緩解期10個月；穩(wěn)定率20%（4例），中數(shù)緩解期9個月；進展10%（2例）。表明NCTD 治療肝癌具有癥狀消失快、體重增加、中數(shù)治療后生存期也明顯延長的優(yōu)點。

3.2 升高白細胞 臨床研究發(fā)現(xiàn)NCTD 亦具有升高白細胞的作用，是目前唯一具有此作用的抗腫瘤藥物。鄭英蘭等［7］取介入治療的原發(fā)性肝癌患者80例，介入治療4個月中聯(lián)合給予NCTD，觀察介入聯(lián)合NCTD的療效。發(fā)現(xiàn)治療后實驗組白細胞計數(shù)明顯高于對照組，而且實驗組的白細胞總數(shù)有逐漸增多的趨勢，說明NCTD 有獨特的升高白細胞作用。這種作用原理，早期可能是加速骨髓成熟或釋放所致，后期則可能是與促造血干細胞的增殖并向粒-單系祖細胞不斷分化有關(guān)。

3.3 抗纖維化 纖維化可發(fā)生于多種器官，主要病理改變?yōu)槠鞴俳M織內(nèi)纖維結(jié)締組織增多，實質(zhì)細胞減少，持續(xù)進展可致器官結(jié)構(gòu)破壞和功能減退，乃至衰竭，嚴重威脅人類健康和生命。目前纖維化類疾病在臨床上缺乏有效的治療方法，尋找新的抗纖維化藥物顯得尤為迫切。Li 等［8］將腎小管模型SD 大鼠分為對照組、NCTD 低劑量組（每日0.05 mg/kg）、NCTD 高劑量組（每日1 mg/kg）。NCTD 每日給藥1次，分別于給藥后的第1 周和第8 周處死小鼠，免疫組化測FN、膠原蛋白Ⅳ、TGF-β1 和磷酸酶的表達。結(jié)果高低濃度NCTD 均能降低FN、膠原蛋白Ⅳ、TGF-β1 和磷酸酶的表達，表明去甲斑蝥素能抑制腎小管纖維化。

3.4 抗病毒 斑蝥素具有較強的抗RNA、DNA 病毒作用，內(nèi)服治療乙型肝炎，外涂治療尖銳濕疣，均取得較好療效。研究表明斑蝥制劑有良好的抗病毒作用，甲基斑蝥素對2.2.15 細胞株分泌的HBsAg 和HBeAg 具有抑制作用，并有一定抗HBV 病毒作用，為臨床應(yīng)用甲基斑蝥胺抗乙型肝炎抗病毒治療提供理論依據(jù)［9-10］。斑蝥膏外涂治療尖銳濕疣，由于乳膏吸收后殺死疣體中病毒，而使疣體變色、萎縮、脫落，取得非常理想的效果［11］。

4 展 望

從中藥中分離有效的抗癌活性成分是尋找新抗癌藥物的有效途徑之一。具有療效顯著、毒性小等特點的NCTD 已被證實具有較為肯定的抗腫瘤作用。但迄今為止，對其抗腫瘤作用具體的分子機制仍不完全明確，同時還缺乏臨床前多種動物模型的實驗資料，包括器官特異性、劑量效應(yīng)關(guān)系等，因此NCTD 要真正進入臨床實驗以及最終成為抗腫瘤藥物仍需要進行更深入的研究。我國的斑蝥資源十分豐富，使斑蝥成為具有重大研究開發(fā)價值的藥用資源，我們應(yīng)更深入地研究斑蝥的藥理作用，這從而發(fā)揮出巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。

［1］李功權(quán)，張水軍，呂建鋒，等.去甲斑蝥素誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的實驗觀察［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2010，90（30）：2145-2148.

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［5］徐小峰，陳文萍，徐玲，等.去甲斑蝥素對CXCR4表達及MCF-7 細胞遷移的影響［J］.中國生化藥物雜志，2010，31（2）：122-125.

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