劉 楠， 李 巖， 牛振華綜述， 于雪凡審校

細胞凋亡是一種相對有序的能量依賴的程序化死亡過程，廣泛存在于多細胞生物的各種器官和組織中。截止到目前，細胞凋亡通路主要有:死亡受體活化(外源性途徑)途徑、線粒體損傷途徑(內源性途徑)和內質網(wǎng)應激誘導的凋亡途徑。前兩者是經(jīng)典凋亡途徑，內質網(wǎng)應激途徑是近年來才發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡途徑。

內質網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是真核細胞中重要的細胞器，它由封閉的膜系統(tǒng)及其圍成的腔形成互相溝通的網(wǎng)狀結構，對細胞正常功能的維持至關重要。內質網(wǎng)在調節(jié)膜蛋白、分泌蛋白的折疊與加工、鈣的儲存與釋放方面具有重要的作用。內質網(wǎng)同時也是類固醇、膽固醇和脂質的合成部位。研究表明，當內質網(wǎng)固有蛋白折疊或加工過程受阻、鈣離子穩(wěn)態(tài)被打破時，細胞將發(fā)生致死性的損害［1］。缺血/缺氧、鈣超載、氧化應激等均可導致未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內質網(wǎng)聚集，引起內質網(wǎng)功能障礙，從而觸發(fā)內質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。研究證實，許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病均與內質網(wǎng)功能障礙有關，包括缺血性腦卒中、阿爾茲海默病、帕金森病等。本文就內質網(wǎng)應激介導的神經(jīng)細胞凋亡信號通路進行如下綜述。

1 未折疊蛋白反應

內質網(wǎng)應激時，細胞通過啟動未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)特異信號系統(tǒng)抑制蛋白翻譯，促進未折疊蛋白加工成熟和促進錯誤折疊蛋白降解，減輕ER蛋白負荷并促進細胞重建內質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。能夠感知ER腔內未折疊蛋白聚集的感受器主要是3個ER跨膜蛋白，即PERK(PKR-like ER kinase)、IRE1α(inositol requiting enzyme 1α)及 ATF6(activating transcription factor 6)。生理狀態(tài)下，內質網(wǎng)分子伴侶GRP78/BIP(glucose-regulated protein 78/binding immunoglobulin protein)分別與PERK、IRE1α、ATF6暴露于ER腔中的結構域結合，處于非活化狀態(tài)。內質網(wǎng)功能障礙時，未折疊蛋白大量聚集，GRP78便與PERK、IRE1α、ATF6解離，轉而與未折疊蛋白結合，由此促進蛋白質的正確折疊。PERK、IRE1α與GRP78解離后發(fā)生二聚化和自身磷酸化，從而被激活。PERK激活后特異性的磷酸化真核起始因子2的α亞單位(eIF2α)。磷酸化的eIF2α有抑制翻譯起始因子的功能，從而抑制大多數(shù)mRNA的翻譯、減少蛋白質的合成。

IRE1α被自身磷酸化激活后具有核酸內切酶活性，激活的IRE1α能從XBP-1 mRNA中特異性剪切26個堿基的內含子，改變XBP-1 mRNA的開放閱讀框，其翻譯產物XBP-1能促進含ERS反應元件(endoplasmic reticulum stress responsive element，ERSE)的UPR靶分子如GRP78、GRP94表達，以減輕或中止ERS反應，從而恢復細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)。研究證實［2］，XBP-1是UPR重要的轉錄激活劑，對神經(jīng)細胞具有保護作用。

與GRP78解離后，ATF6以囊泡轉移的方式從內質網(wǎng)轉移到高爾基體，在高爾基體內被絲氨酸蛋白酶S1P(site-1 protease)和S2P(site-2 protease)切割，產生游離的50kD的N端片段，并轉移到核內與內質網(wǎng)應激基因的ERSE結合，包括GRP78、GRP94、ERp72、PDI和 CHOP，它們對于內質網(wǎng)功能的恢復是必須的。

綜上所述，內質網(wǎng)功能障礙時可通過UPR自我信號轉導通路減弱ERS，減少未折疊蛋白的生成。然而，如果ERS嚴重且持續(xù)時間長，UPR最終會啟動凋亡通路，導致神經(jīng)細胞凋亡。

2 內質網(wǎng)應激介導的神經(jīng)細胞凋亡通路

PERK、ATF6以及IRE-1α信號不僅能夠啟動ERS的生存途徑，嚴重或長時間的ERS損傷了ER的功能時，這3個信號通路同樣能夠啟動由ERS所介導的凋亡信號通路，誘導細胞凋亡。然而它們并不是直接引起細胞凋亡的，而是通過激活下游的凋亡信號分子，如CHOP/GADD153、JNK、caspase-12以及GSK-3/3β。研究表明，線粒體功能障礙也是內質網(wǎng)應激介導凋亡的重要促進因子。

2.1 CHOP 通路 CHOP/GADD153(growth arrest and DNA-damage-inducible gene 153)是內質網(wǎng)應激特異的一個轉錄因子，屬于C/EBP轉錄因子家族成員。CHOP含有一個N端轉錄激活域和C端的堿性鋅指(bZIP)結構域。PERK、ATF6以及IRE1都能誘導CHOP的轉錄，其中PERK-eIF2α-ATF4是CHOP蛋白表達的主要途徑。如上所述，PERK與GRP78解離后發(fā)生二聚化和自身磷酸化，從而被激活。PERK激活后特異性的磷酸化eIF2α。內質網(wǎng)應激無法挽救時，大量磷酸化的eIF2α使核糖體到達ATF4的開放閱讀框架允許ATF4的轉錄，ATF4進入細胞核后便激活CHOP的轉錄。研究發(fā)現(xiàn)［3］，PERK信號通路的激活可以減弱Aβ介導的內質網(wǎng)應激，說明PERK-eIF2α通路可以作為神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病如阿爾茲海默病潛在的治療靶點。研究還發(fā)現(xiàn)［4］，對SH-SY5Y細胞施行IRE1敲除后CHOP的表達下調，表明CHOP是經(jīng)IRE1激活的重要凋亡分子。

CHOP介導的神經(jīng)細胞凋亡機制總結如下:(1)下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達:研究發(fā)現(xiàn)［5］，CHOP的過度表達造成Bcl-2的下調、細胞內谷胱甘肽的耗竭、活性氧產物積增。(2)調節(jié)BIM和PUMA的誘導:最近的一項研究已經(jīng)證實在ERS誘導的細胞凋亡中，ATF4-CHOP介導的Bcl-2家族成員PUMA的反式激活信號通路的存在。研究者發(fā)現(xiàn)ATF-4缺乏的神經(jīng)元表現(xiàn)出PUMA表達水平的明顯下調。此外，ATF4可以誘導轉錄因子CHOP的表達，反過來CHOP可以激活PUMA的誘導。他們還證實了ERS時CHOP與PUMA啟動子結合，并且當CHOP被敲除時減弱了PUMA誘導和神經(jīng)元凋亡［6］。(3)上調 DR5的表達:DR5編碼細胞表面死亡受體，進而激活caspase級聯(lián)反應。CHOP通過與DR5基因的5’旁側區(qū)結合來調節(jié)DR5的轉錄。人類神經(jīng)母細胞SHSY5Y細胞經(jīng)衣霉素誘導后，DR5表達明顯增加，這與CHOP的表達上調是一致的，并且兩者的上調均可被腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子抑制［7］。因此，DR5很可能是CHOP下游的凋亡因子。

2.2 JNK通路 JNK屬于絲裂原活化蛋白激酶(MAPKKK)家族，JNK主要介導應激反應，因此又稱應激激活蛋白激酶(SAPK)。短暫的JNK可以促進細胞的生存，長期的JNK通路激活可以促進細胞的凋亡。ERS通過 IRE1α-TRAF2-ASK1通路和 MLK(mixed lineage kinases complex)復合體激活JNK通路。

如上所述，UPR時IRE1α與GRP78解離后發(fā)生二聚化和自身磷酸化，從而被激活。持續(xù)的IRE1α二聚化可導致凋亡信號調節(jié)激酶(ASK1)及其下游底物JNK的活化。JNK磷酸化既可以激活凋亡蛋白BIM，又可以抑制抗凋亡蛋白Bcl-2。研究發(fā)現(xiàn)［8］，ASK1的小分子調節(jié)劑可以保護細胞免受內質網(wǎng)應激誘導的凋亡，說明IRE1α-ASK1-JNK是一條重要凋亡信號通路。ASK1(apoptosis signal-regulating kinase 1)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是MAPK(mitogen-activated protein kinase)家族的一員，可以激活 JNK和 p38信號通路［9］。Nishitoh H等人研究發(fā)現(xiàn)［10］，PC12細胞經(jīng)過毒胡蘿卜素(一種內質網(wǎng)應激誘導劑，能夠引起UPR)或衣霉素(內質網(wǎng)N-糖基化抑制劑)誘導后可以活化ASK1和JNK，表明ERS激活了ASK1-JNK通路。此外，ASK1與IRE1α只有在TRAF2(tumor necrosis factor receptor associated factor 2)和毒胡蘿卜素都存在的情況下才表現(xiàn)出相關性，這表明ERS誘導了內質網(wǎng)外膜IRE1-TRAF2-ASK1復合體的形成，進而激活了ASK1-JNK信號通路。以上說明ASK1在發(fā)生ERS時是主宰細胞命運的關鍵因素。

MLK是一種通過磷酸化作用激活MAPK通路的絲/蘇氨酸蛋白激酶。目前為止，MLK已經(jīng)有7個家族成員被發(fā)現(xiàn)，根據(jù)他們的催化亞基不同，又可以分為3個亞家族:MLKs、DLKs和 ZAKs。MLKs包括 MLK1、MLK2(MST)和 MLK3(SPRK/PTK)。MLK3，是分子量為93kD的一個成員，MLK3作為JNK級聯(lián)上游的重要活化因子，通過直接磷酸化并激活中游MKK4/7蛋白激酶，從而激活JNK應激信號通路［11～13］。MLK3介導了JNK誘導的神經(jīng)細胞凋亡和腦缺血損傷通路，并因此受到重視。

2.3 caspase-12通路 caspase-12定位于ER外膜，是介導ERS凋亡的關鍵分子，在死亡受體或線粒體凋亡途徑中不被活化。caspase-12缺陷鼠能抵抗ERS引起的凋亡而其他死亡刺激仍可誘導其發(fā)生凋亡，表明caspase-12與ERS介導凋亡的機制有關，而與非ERS介導的凋亡無關［14］。ERS時，以下信號通路可以激活caspase-12:(1)Ca2+依賴的calpain活化:calpain(鈣蛋白酶)是細胞質中另一半胱氨酸蛋白酶家族成員，其活化依賴于Ca2+的存在。在ERS時，細胞內Ca2+水平的升高引起細胞質calpain活化，剪切定位于ER膜上的procaspase-12，使之活化并釋放入細胞質［15，16］。有證據(jù)表明，calpain的激活與很多疾病的形成有關，像缺血性腦損傷、阿爾茨海默病等。Nakagawa［15］研究發(fā)現(xiàn)，被剝奪氧和葡萄糖的神經(jīng)膠質細胞會引起calpain和caspase-12的激活。應用calpain抑制劑后，caspase-12的切割被抑制，說明calpain激活了caspase-12。在皮質神經(jīng)元細胞中也得到了相同結果。(2)TRAF2依賴性機制:在HEK293T細胞中已經(jīng)證實，在非應激狀態(tài)下，TRAF2與procaspase-12形成穩(wěn)定的復合物，而ERS可導致procaspase-12與TRAF2分離，引起caspase-12活化，并同時引起JNK-IRE1復合物募集TRAF2，導致JNK磷酸化而活化［17］。神經(jīng)元蠟樣脂褐氏沉積病的CLN8(mnd)大鼠模型也證實了以上結果［18］。(3)caspase-7 ER轉位:ERS引起caspase-7移位至內質網(wǎng)表面，與caspase-12形成復合物并在Asp94和Asp341處切割procaspase-12，破壞了膜與 caspase-12的聯(lián)系，使之活化并釋放于細胞質。caspase-12目前僅在鼠中得到克隆物，而人體中的caspase-12因為基因突變而喪失了調控凋亡的作用，但可能是其同源異構體caspase-4發(fā)揮相同作用。caspase-12的作用，目前的研究還不是很透徹。對caspase-12的了解，將對人類caspase-4的研究提供科學依據(jù)和借鑒。

2.4 GSK3/3β介導的凋亡通路 糖原合成酶激酶-3(GSK-3)是一種在進化上非常保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，主要有兩種亞型，即GSK-3α和GSK-3β。GSK-3β高度表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)并具有神經(jīng)系統(tǒng)特異性。GSK-3β能作用于眾多信號蛋白、結構蛋白和轉錄因子，調節(jié)細胞的分化、增殖、存活和凋亡。GSK-3β在細胞內活性受雙位點磷酸化調控，在Tyr216磷酸化激活，在Tyr216去磷酸化或者在Ser9磷酸化而失活。研究已經(jīng)證實［19，20］，GSK-3β 與 ERS介導的神經(jīng)細胞凋亡信號通路相關，使用GSK-3抑制劑可以減弱ERS介導的細胞凋亡，但GSK-3確切的促凋亡機制目前尚不完全清楚。Meares GP等人研究發(fā)現(xiàn)［21］，給予GSK-3抑制劑鋰可以保護SH-SY5Y細胞及永生化大鼠海馬神經(jīng)元免受毒胡蘿卜素、衣霉素和布雷菲德菌素A誘導的ERS。GSK-3抑制劑也可以保護小腦顆粒神經(jīng)元免受布雷菲德菌素A誘導的ERS及其凋亡，保護SH-SY5Y細胞、PC12細胞、小腦顆粒神經(jīng)元免受6-羥多巴胺誘導的ERS及凋亡，保護PC12細胞免受毒胡蘿卜素誘導的ERS及凋亡。目前GSK-3抑制劑可能的保護機制包括抑制Bax的活化，上調GRP78和bcl-2的表達、降低細胞內鈣水平和降低CHOP的表達。

2.5 內質網(wǎng)應激與線粒體 近年來研究證實，神經(jīng)細胞凋亡機制中內質網(wǎng)與線粒體之間存在串擾［22，23］。線粒體外膜是位于線粒體最外圍的一層單位膜，厚度約為6～7nm。高分辨三維X射線攝影可見內質網(wǎng)及線粒體之間有20%的膜是緊密接觸的，在這些接觸位點上線粒體外膜與內質網(wǎng)膜通過某些蛋白質相連，形成稱為“線粒體結合內質網(wǎng)膜”(mitochondria-associated ER-membrane，MAM)的結構。該結構在脂質的相互交換和線粒體與內質網(wǎng)間的鈣離子信號傳導等過程中都有重要作用。長時間過強的ERS導致Ca2+從內質網(wǎng)腔內釋放到MAM，進而引起線粒體基質攝取過量Ca2+。Ca2+的過量攝入會擾亂線粒體內的Ca2+穩(wěn)態(tài)，持續(xù)的Ca2+聚積會導致線粒體通透性轉化孔(mtPTP)的開放，促進CytC釋放，激活caspase-9，進而激活下游caspases-3，引發(fā)死亡蛋白酶caspase級聯(lián)反應，最后導致細胞凋亡。因此，ERS時可激活線粒體介導的凋亡通路，ERS是線粒體應激發(fā)生發(fā)展的始動環(huán)節(jié)。

3 結論與展望

內質網(wǎng)對于細胞正常功能的維持是必不可少的。ERS誘導的細胞凋亡廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，包括腦缺血性卒中、阿爾茲海默病、帕金森病等，所以內質網(wǎng)有望成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的新靶點。鑒于內質網(wǎng)應激時自我保護機制UPR的存在，提示人們基于這種分子機制和信號轉導途徑可能實現(xiàn)內質網(wǎng)應激誘發(fā)損傷的保護以及相關疾病的干預。Taurine(2-氨基乙磺酸)，抑制性神經(jīng)遞質，是廣泛存在于哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的最多的游離氨基酸。近來，Gharibani等人的研究發(fā)現(xiàn)［24］，Taurine可以減弱低氧/復氧及缺血誘導的內質網(wǎng)應激，作用機制是阻斷ATF6和IRE1通路活化，這在PC12細胞及大鼠MCAO模型中均得到證實。此外，基于內質網(wǎng)應激凋亡通路的相關分子可給予相應抑制劑進行阻斷。Parecoxib，一種新的COX-2抑制劑，可以作為神經(jīng)保護劑，挽救腦缺血再灌注損傷后內質網(wǎng)應激介導的神經(jīng)細胞凋亡。近來，Ye Zhi等人發(fā)現(xiàn)［25］，Parecoxib可以顯著抑制缺血半暗帶CHOP的表達及caspase-12的免疫活性，進而減輕神經(jīng)細胞凋亡?？傊?，內質網(wǎng)應激介導的神經(jīng)細胞凋亡機制及其相關保護方案仍有待進一步研究，以幫助我們全面的深層次的了解內質網(wǎng)應激在神經(jīng)細胞凋亡中的作用，并為臨床疾病治療方案提供堅實的理論基礎。

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