Ott HC 著 王水良 譚建明 譯

?研究進(jìn)展?

人工肺的生物重建和原位移植

Ott HC 著 王水良 譚建明 譯

僅在美國，每年約有二千五百萬慢性阻塞性肺病患者，其中大約有十二萬病人死于終末期肺病。對終末期肺病患者而言，肺移植是迄今唯一療效確切的治療手段。但就像其他器官一樣，供體肺來源非常有限，以美國為例，在2005年僅四分之一等待肺移植的患者通過全美器官共享網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)了器官移植，此外，肺移植后的長期效果還常常因慢性排斥反應(yīng)和免疫抑制治療的副作用而備受損害。鑒于此，重建自體人工生物肺理論上應(yīng)可規(guī)避上述問題，而為滿足移植所需，重建的人工肺應(yīng)具有與正常供體肺類似功能。此前已有多種方法被應(yīng)用于構(gòu)建具有功能的肺組織，從應(yīng)用高分子多聚物和天然材料如膠原等的結(jié)果看來，細(xì)胞外基質(zhì)的作用不僅在于為肺臟提供基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)并賦予其相應(yīng)的物理屬性，還與肺細(xì)胞的分化密切相關(guān)。雖然在體外和體內(nèi)可定向分化為肺結(jié)構(gòu)的成體和胚胎性候選細(xì)胞業(yè)已分離得到，但由于目前尚無法獲得生物可降解的、具高彈性的肺支架以構(gòu)建氣道、肺泡和脈管等肺的復(fù)雜結(jié)構(gòu)并滿足大面積氣體交換之所需，所以重建能通過患者氣道通氣和脈管系統(tǒng)灌注實(shí)質(zhì)性肺組織的嘗試大都無疾而終。

在此前報(bào)道的心臟重建以及最近應(yīng)用于肝臟重建的方法之間，本研究選擇嘗試通過灌洗法使尸肺去細(xì)胞化以獲得具有可灌注的脈管床并保留有氣道和肺泡幾何結(jié)構(gòu)的完整肺支架。近來，基于一種無細(xì)胞基質(zhì)支架而構(gòu)建的組織工程氣道在臨床成功植入的報(bào)道展示了該法在呼吸系統(tǒng)功能紊亂治療中極大的潛在應(yīng)用價(jià)值，盡管該結(jié)構(gòu)復(fù)雜性相對較低。去細(xì)胞化的肺支架在確認(rèn)保有細(xì)胞外基質(zhì)成分以及完整性和機(jī)械屬性后，再植入內(nèi)皮和上皮細(xì)胞，通過慢性肺動脈灌流和通氣可使其逐步形成具通氣、血流灌注和氣體交換等功能的重建肺。最后，重建人工肺經(jīng)原位移植并連接至受體血管和支氣管系統(tǒng)后成功地實(shí)現(xiàn)了活體內(nèi)的氣體交換功能。

首先，研究人員應(yīng)用低濃度（0.1﹪）的十二烷基硫酸鈉（SDS）在生理性壓力下灌洗大鼠尸肺獲得了完整的無細(xì)胞肺支架。組織學(xué)評估顯示，灌洗后的肺實(shí)質(zhì)并無細(xì)胞核或細(xì)胞內(nèi)其余成分的殘存，但仍保留有細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。灌洗法去細(xì)胞化并不累及氣道和脈管系統(tǒng)的基質(zhì)結(jié)構(gòu)，氣道和肺泡的彈性纖維網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)也得以完整保存。電子顯微鏡下觀察也表明，除細(xì)胞缺失外，氣道、肺泡和毛細(xì)管網(wǎng)絡(luò)的基底膜仍完整保留。Western blot蛋白印跡法分析也表明去細(xì)胞支架無表面活性蛋白、Clara細(xì)胞分泌蛋白（CCSP和CC10）或CD31等蛋白的殘余。同時(shí)，應(yīng)用經(jīng)簡單改進(jìn)的SDS灌洗法也可成功地獲得去細(xì)胞化的綿羊、豬和狒狒的肺支架，鑒于這些種屬的器官大小與人類似，提示該灌洗法在人肺的去細(xì)胞化中也具可行性。

通過基于肺特異組織學(xué)的形態(tài)計(jì)量學(xué)和體視學(xué)法分析發(fā)現(xiàn)，與自然肺相比，去細(xì)胞化肺的肺泡隔體積百分比下降，相應(yīng)地間隙體積百分比和肺泡腔體積百分比均上升。不過，二者間肺泡數(shù)量和肺泡大小則無顯著差異，表明去細(xì)胞化肺支架的肺泡隔及其表面積仍保留完好。通過動態(tài)肺功能測試發(fā)現(xiàn)，去細(xì)胞化的肺其順應(yīng)性有所下降，肺活量低于正常肺。鑒于在重新植入細(xì)胞前再灌注常見有肺和間質(zhì)水腫，以及表面活性物質(zhì)的缺乏，去細(xì)胞化肺支架順應(yīng)性的下降也與預(yù)期相符。

為驗(yàn)證去細(xì)胞后是否可以再細(xì)胞化，研究人員將無細(xì)胞的大鼠肺支架置入一特制的、能在恢復(fù)氣體呼吸功能之前刺激肺發(fā)育環(huán)境的生物反應(yīng)器中，再嘗試將dsRed標(biāo)記的人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）重新植入無細(xì)胞肺支架，結(jié)果表明，離體器官在歷經(jīng)5 d的培養(yǎng)后全支架范圍內(nèi)均可見內(nèi)皮細(xì)胞的分散和植入。同樣地，為檢驗(yàn)支架的生物相容性以及生物反應(yīng)器和培養(yǎng)條件，研究者又經(jīng)由氣管將人肺泡基底上皮源性癌細(xì)胞A549種植入支架，該再植細(xì)胞肺在離體器官培養(yǎng)條件下可維系9 d。A549細(xì)胞均勻分布，在全肺結(jié)構(gòu)范圍內(nèi)即可見細(xì)胞的植入和單層上皮結(jié)構(gòu)的形成，并保有實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)。

為保留氣體交換組織結(jié)構(gòu)，研究者又將大鼠胎肺細(xì)胞（FLC）和HUVEC聯(lián)合種植入去細(xì)胞化的尸肺中。待去細(xì)胞肺支架的全血管系統(tǒng)再內(nèi)皮化以后，在小管發(fā)育晚期（妊娠第19 ～ 20天）分離大鼠胎肺并經(jīng)酶消化法制備FLC的單細(xì)胞懸液，該細(xì)胞懸液再經(jīng)由去細(xì)胞氣管滴注入支架。生理?xiàng)l件下，重植入細(xì)胞的全肺結(jié)構(gòu)可培養(yǎng)9 d。在培養(yǎng)至第5天時(shí)所行的組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，全肺支架均可見有上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的植入，并保留有大和小氣道、肺泡和血管等結(jié)構(gòu)。FLC植入肺細(xì)胞外基質(zhì)并在傳導(dǎo)性氣道和肺泡形成再生性上皮。重建肺結(jié)構(gòu)的氣管和大氣道均見襯有無纖毛、無分泌功能的鱗狀樣上皮，而更遠(yuǎn)端的氣管如遠(yuǎn)端支氣管則可見有立方樣上皮的覆蓋。在透射電子顯微鏡下觀察還可見，肺泡壁細(xì)胞重新植入肺泡隔基底膜，肺泡-毛細(xì)血管屏障完整，其厚約0.2 ～ 4 μm，提示已具備滿足一定彌散量所需的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)。此外，重組肺組織經(jīng)蛋白免疫印跡法分析，結(jié)果表明，F(xiàn)LC種植的肺結(jié)構(gòu)在體外培養(yǎng)5 d后可見有表面活性蛋白A和C（SP-A、SP-C）的表達(dá)。

形態(tài)計(jì)量學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，重建肺實(shí)質(zhì)的體積百分比與自然肺相當(dāng)，但比去細(xì)胞化肺高。重建肺的肺泡體積百分比也與自然肺無異，僅略微低于去細(xì)胞化肺。立體學(xué)法分析表明，重建肺的肺泡數(shù)和大小均與自然肺無甚差別。如此看來，去細(xì)胞肺支架經(jīng)內(nèi)皮和上皮細(xì)胞再植并經(jīng)生理?xiàng)l件下生物反應(yīng)器中培養(yǎng)后可成功地重建成肺組織，且其肺泡體積、數(shù)目和大小與自然肺類似。

鑒于肺組織的首要功能在于允許循環(huán)血和吸入氣間的氣體交換，因此在全器官培養(yǎng)5 d后，研究人員將原來的液相通氣改為干性通氣以測試重建肺經(jīng)人紅細(xì)胞灌注后在生理性通氣壓力下的氣體交換能力。實(shí)驗(yàn)各組間灌注液的血?dú)夥治霾o差異。通過肺靜脈流出液的血?dú)夥治霭l(fā)現(xiàn)，HUVEC和A549再植重建肺的通氣能力接近新鮮分離肺的30﹪；而HUVEC和FLC再植的重建肺的通氣能力明顯提升，幾乎可與新鮮分離的自然肺通氣功能匹敵。就動態(tài)肺功能測試結(jié)果看，HUVEC和FLC再植重建肺的肺活量和肺順應(yīng)性均與自然肺相仿。

最后，鑒于FLC再植的人工重建肺在體外的通氣力學(xué)和通氣功能幾乎與自然肺相當(dāng)，故此研究人員將其原位移植以期測試是否它也能在體內(nèi)正常發(fā)揮功能。受體經(jīng)左肺切除術(shù)后，供肺與受體的肺動脈、肺靜脈和左主支氣管分別吻合以行人工重建肺的原位移植。X射線透視檢查示重建肺原位移植后可即實(shí)現(xiàn)灌注并行肺通氣功能，移植后1 h內(nèi)未見肺實(shí)質(zhì)出血、肺水腫和氣漏等現(xiàn)象，重建肺的X射線透射性也與自然肺相當(dāng)。所有行左肺切除術(shù)的大鼠其肺動脈氧分壓均下降，然而，那些再行人工重建肺原位移植的大鼠其動脈氧分壓在肺門再通后10 min和30 min時(shí)明顯改善，而左肺切除但未移植重建肺的對照大鼠動脈氧分壓則未見增加。一組實(shí)驗(yàn)大鼠在急性實(shí)驗(yàn)后任其自行復(fù)蘇，移植后拔管并在無輔助通氣的情況下，生物重建肺的在體氣體交換功能可維持至拔管后6 h以上。

綜上所述，在本研究中首先通過灌洗去細(xì)胞化法獲得具三維結(jié)構(gòu)的完整肺支架，再行肺支架表面內(nèi)皮和上皮細(xì)胞共同再植并經(jīng)體外培養(yǎng)，成功地重建了具備體外和體內(nèi)通氣功能的人工生物肺。同時(shí)，人工重建肺原位移植的成功也表明，研究者建立的方法在體外重建肺葉乃至全肺中切實(shí)可行，在未來終末肺病患者的肺移植治療中極具臨床意義。在獲得去細(xì)胞化的完整肺支架后，研究者選擇聯(lián)合HUVEC和源自小管發(fā)育期大鼠胚胎的FLC再植，因?yàn)檫@一時(shí)期的胚胎已可見Ⅱ型肺泡細(xì)胞，但尚未形成成熟的肺泡；亦即這一特殊發(fā)育時(shí)相的細(xì)胞因其既定的肺泡細(xì)胞發(fā)育定向但仍對基質(zhì)介導(dǎo)的生長刺激具反應(yīng)性，因而尤其適用于肺重建試驗(yàn)。此外，為便于人工重建肺組織的成熟，研究者特別設(shè)計(jì)了能模擬胎肺發(fā)育環(huán)境的生物反應(yīng)器，置于其中的無細(xì)胞肺支架所承載的機(jī)械張力與正常胚胎血液循環(huán)和呼吸運(yùn)動時(shí)相類似，并包括了胎肺生長發(fā)育所必須的成份。將細(xì)胞再植的支架置入生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，可見細(xì)胞逐漸嵌入支架并形成內(nèi)皮、初級呼吸和肺泡上皮。更為重要的是，細(xì)胞再植和體外培養(yǎng)可重建具生理厚度的肺泡-毛細(xì)血管屏障，從而重建肺換氣的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)；且作為肺功能單位的肺泡數(shù)目和大小基本與自然肺無異，體外通氣和血流灌注也證實(shí)了重建肺的生理性通氣力學(xué)和氣體交換功能。該重建肺原位移植入左肺切除的受體后可經(jīng)受體的肺動脈和靜脈實(shí)現(xiàn)再灌注，且能通過受體的氣管通氣。實(shí)驗(yàn)大鼠在移植后可成功拔管，并在無輔助通氣的情況下呼吸。

誠然，要實(shí)現(xiàn)更佳效果的體外器官重建，多環(huán)節(jié)的進(jìn)一步優(yōu)化仍在所難免。首先，再植入重建器官支架細(xì)胞的分化和成熟條件尚有待改進(jìn)；同時(shí)，移植前在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)時(shí)間的延長也表明重建肺的實(shí)質(zhì)和氣管都更為成熟，因而在外形和功能上也更接近自然肺。除了再植細(xì)胞的選擇，促分化和成熟策略、最佳移植物的獲取和理想的重建肺移植術(shù)后通氣程式都有待進(jìn)一步的優(yōu)化。在后續(xù)的研究中，重建肺體外培養(yǎng)成熟至何程度即可取得最佳的體內(nèi)長期移植效果、以及移植后體內(nèi)成熟和宿主細(xì)胞滲入至何程度方可完成器官的重建是有必要重點(diǎn)闡明的問題。

（本文編譯自：Ott HC, Clippinger B, Conrad C, et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioarti fi cial lung [J]. Nat Med, 2010, 16(8): 927- 933.)

2013-01-19)

(本文編輯：陳媛媛)

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2013.02.010

Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, USA

Ott HC. 人工肺的生物重建和原位移植[J/CD]. 王水良, 譚建明, 譯.中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志:電子版, 2013, 3(2): 103-105..