谷涌泉 佟鑄

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干細胞移植促進血管新生的研究進展

谷涌泉 佟鑄

血管新生是機體在生理和病理狀態(tài)下發(fā)生的重要過程，參與機體的諸多方面。血管新生是一個復雜的過程，可分為早期和晚期二個階段[1]。早期階段包括血管內(nèi)皮細胞（vascular endothelial cell，VEC）的前體細胞分化、增殖、遷移，融合成初期血管網(wǎng)絡。晚期階段包括血管芽生、分支，形成小血管，血管支持細胞分泌充實在新生血管周圍，從而在原有血管基礎上形成新的成熟血管。

在闡述血管新生與腫瘤相互關系的同時，有研究預言用促進血管新生的方法即治療性血管新生來治療缺血性疾病的前景[2]。目前治療性血管新生通過直接應用多種血管生成誘導劑（如局部或動脈內(nèi)使用VEGF、bFGF），或采用血管生成因子相關的基因治療方法在心腦缺血性疾病的動物實驗和臨床試驗中已經(jīng)獲得顯著療效。然而，治療性血管新生的失控性問題及不良反應等，降低了該策略的臨床可行性。在治療性血管形成方面,國內(nèi)外學者應用多種干（祖）細胞在治療下肢缺血、心肌缺血、腦缺血等方面的研究，已取得了令人鼓舞的效果[3]。

一、內(nèi)皮祖細胞與血管新生

血管內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cell，EPC）被認為是血管新生的主要“物質(zhì)基礎”，EPC是VEC的前體，亦稱成血管細胞（angioblast）[4]。該細胞最早被Asahara等[5]證明存在于循環(huán)外周血中并能分化為VEC，在缺血刺激下可通過動員到外周血，遷移、歸巢到血管新生部位，并在遷移部位增殖、分化為內(nèi)皮細胞（endothelial cell，EC），在體內(nèi)具有明顯的內(nèi)皮修復及促血管新生作用。

人在病理狀況下，骨髓中的EPC可以被動員到外周血中，逐漸遷移、定居于缺血組織，并分化、嵌合入新血管，該過程也分別稱為EPC的動員、歸巢和分化。大多數(shù)研究表明EPC血管新生的機制可能有兩方面：一是遷移到局部分化成成熟的EC；二是通過自分泌和旁分泌機制分泌促血管生成因子，如VEGF、HGF、IGF-1、G-CSF等[6]。

EPC能促血管新生和修復內(nèi)皮：EPC屬于干細胞，它促進血管形成而無需依賴血管系統(tǒng)，其作用機制主要有兩個方面：一是分泌功能，有研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的EPC能夠分泌促血管生長因子，如VEGF、粒細胞克隆刺激因子、粒巨細胞克隆刺激因子等，二是EPC的歸巢作用，當血管出現(xiàn)損傷時候，EPC通過歸巢能直接到達受損的血管，進而分化、發(fā)育為新生管,并參與血管新生和內(nèi)皮損傷修復[7]。

Tateishi-Yuyama等[8]首次報道應用自體單個核細胞（富含EPC）移植治療下肢缺血性疾病，開創(chuàng)了血管新生在臨床應用的先例。筆者首先在國內(nèi)應用自體單個核細胞移植治療下肢缺血性疾病并取得了成功[9]，目前已經(jīng)治療了500余例患者，取得了令人興奮的療效[10-12]。筆者不僅采用了國外的方法，即下肢肌肉局部注射，而且還在國際上率先采用了經(jīng)下肢動脈導管注射的新方法，對這2種不同自體骨髓干細胞移植的方法治療嚴重下肢缺血性疾病進行了對比。發(fā)現(xiàn)這2種方法的療效差異無統(tǒng)計學意義。

中國醫(yī)學科學院天津血液病研究所黃平平等[13]在采用外周血單個核細胞治療白血病的基礎上，采用類似的技術手段，在國際上最早開展了自體外周血單個核細胞移植治療下肢缺血并取得了成功，他們研究的臨床效果很令人鼓舞。筆者和沈陽空軍第463醫(yī)院也相繼開展此技術[14-15]，于2003年12月，到目前為止已經(jīng)治療200余例患者，大多數(shù)患者的臨床癥狀明顯改善。因此認為：自體外周血單個核細胞移植治療下肢缺血性疾病也是一種簡單、安全、有效的方法，然而由于骨髓動員期間，外周血液循環(huán)中單個核細胞的量增加明顯，外周血的黏稠度明顯增加，血管內(nèi)血栓形成的機會大大增加，從而增加心肌梗死或腦梗塞發(fā)生的危險。在臨床研究中就出現(xiàn)了1例心肌梗死和2例腦梗塞，由于骨髓動員早期就采用了正規(guī)的抗凝措施，這些并發(fā)癥表現(xiàn)比較輕微，沒有引起嚴重后果。因此，在整個過程中需要注意心腦血管并發(fā)癥的發(fā)生。

在單純骨髓單個核細胞移植中，骨髓血的抽取量一般在400 ～ 500 ml，得到的骨髓單個核細胞總數(shù)在（1 ～ 3）×109個。由于患者大多年齡比較大，體弱并多伴有其他疾病，如冠狀動脈硬化性心臟病或（和）腦動脈硬化癥等，如果一次抽取過多的骨髓血，勢必造成其他并發(fā)癥。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)：在同等條件下，療效與細胞總數(shù)正相關，即量越大，效果越好。如何在減少每次骨髓血抽取的總量，同時又能增加或至少不降低療效，這是一個挑戰(zhàn)。經(jīng)過努力，已經(jīng)找到了一種新的方法，就是骨髓動員刺激以后的骨髓干細胞移植，也稱之為“改良的骨髓單個核細胞移植”[16]。主要步驟是在抽取骨髓前使用粒細胞集落刺激因子（GSF）刺激骨髓2 ～ 3 d，每天300 μg；然后抽取骨髓血110 ～ 200 ml，在干細胞實驗室分離純化后再進行移植。從資料中發(fā)現(xiàn)：無論是主觀評價指標，或是客觀評價指標均比以前研究結果的療效明顯提高，而且不良反應也較外周血單個核細胞為少。因此，經(jīng)過骨髓動員刺激后的骨髓單個核細胞移植下肢缺血，具有抽取骨髓血少，細胞量多，近期效果好，且安全性高的優(yōu)點。這些優(yōu)勢也在筆者最近完成的隨機對照研究中得到了證實。因此可以說這種技術是除自體骨髓單個核細胞移植和外周血單個核細胞移植以外的又一種治療下肢缺血的新方法，而且隨訪結果也顯示這是一種值得推廣的方法。

中遠期隨訪結果也顯示了無論采用骨髓血來源或是外周血來源的單個核細胞在治療下肢慢性缺血方面具有一定的效果，更重要的是非常安全[17]。

二、間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）與血管新生

MSC是干細胞的一種類型,具備干細胞的自我增殖能力和多向分化潛，廣泛存在于全身的結締組織和器官間質(zhì)中。由于取材容易，易分離,體外可大量擴增，因此，MSC在現(xiàn)代細胞治療中應用前景廣闊，它可用于修復受傷或病變的多種組織器官，可治療心血管疾病[18]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、骨組織病、燒傷燙傷、缺血性血管病、腫瘤等多種疾病。研究表明，適宜條件下MSC具有分化為幾乎所有三胚層類型細胞的能力。已有研究證實MSC可向EC分化[19]，并可促進腫瘤血管形成[20]。當然也有研究者指出MSC能夠抑制EC的增殖和血管新生[21]。

MSC其促血管生長作用機制可能為：MSC含有EC的前體細胞參與血管新生。實驗中觀察到MSC分化形成EC參與了血管形成。MSC可形成和分泌許多血管活性生長因子促進血管新生，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是促進血管生長的主要因子之一，它不僅在生理狀態(tài)下促進新生血管形成，而且在病理狀態(tài)下的新生血管形成中亦起作用[22]。

三、臍血或臍帶血干細胞與血管新生

實驗研究證實，從臍血CD133+細胞中可誘導出內(nèi)皮祖細胞，表現(xiàn)為表達EC標志的貼壁細胞[23]，移植后的內(nèi)皮祖細胞可以在缺血組織分化成EC，整合到缺血部位新生血管內(nèi)，移植EPC后裸鼠缺血后肢的毛細血管密度、血流灌注及壞死程度均較對照組明顯改善。有作者發(fā)現(xiàn)臍血單個核細胞在VEGF等細胞因子的誘導下可定向分化為EC。在臨床中有作者對臍血干細胞移植進行了初步嘗試，Kim等[24]應用臍血干細胞移植治療Buerger's病，結果顯示：細胞移植后患者靜息痛緩解、肢體皮膚潰瘍4周內(nèi)愈合，血管阻力降低，血管造影顯示肢體遠端毛細血管密度增加、直徑增大。

臍血來源豐富，通常被認為醫(yī)療廢物而丟棄，利用臍血進行干細胞研究等于廢物利用，變廢為寶；臍血的收集過程無創(chuàng)、無痛苦、易被孕婦及其家屬接受。相對胚胎干細胞而言,雖然臍血干細胞在分化潛能上不及胚胎干細胞,但是避免了胚胎干細胞研究倫理爭論的焦點問題，應用臍血干細胞進行治療社會倫理學障礙較小。由于以上優(yōu)點，目前認為臍血可能是細胞移植的較好來源，具有廣泛的應用前景[25]。

從1988年第1例臍帶血干細胞移植以來，全世界超過150個國家和地區(qū)已進行了不少于6000例臍帶血干細胞移植。我國先后設置的10個臍血庫中，保存合格臍帶血共計20 000余份。國內(nèi)北京、天津、山東和廣東4個臍血庫已提供臨床移植應用，其中天津臍血庫已提供了多份5 ～ 6個HLA2A、B、DR位點相合的臍帶血，可供選擇供體臍血干細胞的范圍已由同種同基因臍血，擴展到同種異基因臍血干細胞。

研究表明,盡管臍血和骨髓中所含CD34+細胞的百分比無顯著性差異，但在質(zhì)量上卻有差異，CD34+細胞體外長期培養(yǎng)中的初始細胞CD34+CD45+細胞在臍血中明顯高于骨髓，且臍血CD34+CD38-細胞的增殖分化能力高于骨髓。亦有結果顯示臍血富含CD34和CD133共同表達的EPC。同時研究發(fā)現(xiàn)與骨髓和外周血相比，臍血干細胞還具有相對較原始、淋系祖細胞的含量少、免疫原性較弱、能耐受更大程度上的HLA配型不符等生物學特性[26]。

四、脂肪干細胞與血管新生

Zuk等[27]首先通過脂肪抽吸術從脂肪組織中分離出一群具有多向分化潛能的成纖維細胞型細胞，這種細胞被稱為脂肪干細胞，這類干細胞原代是異質(zhì)性的，但大部分來源于間葉細胞，僅見微量EC、平滑肌細胞和周細胞，經(jīng)過幾次傳代以后細胞就會達到同質(zhì)性。研究表明，脂肪干細胞和骨髓MSC十分相似，二者都代表了通過培養(yǎng)瓶內(nèi)黏附法從脂肪庫中分離的基質(zhì)細胞部分。在形態(tài)學上，ASC與BMSC均表現(xiàn)為似成纖維細胞狀,故難以就形態(tài)上進行區(qū)分，而二者的細胞表面抗原標志也大部分相同[28]。有學者觀察了ASC隨著培養(yǎng)傳代其免疫表型的變化，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)細胞相關標志在初分離的間質(zhì)血管碎片（SVF）中水平很低，隨著傳代次數(shù)增加而迅速升高。干細胞相關標志CD34在整個培養(yǎng)和傳代過程中都有表達，但在SVF和傳代早期的ASC中最高。EC相關的CD31、CD144和血管內(nèi)皮生長因子受體2在SVF中低表達，并且隨著傳代無明顯改變。

ASC與BMSC不僅具有相似的細胞形態(tài)及細胞表面標志，也具有相似的分化功能。ASC作為一種多能干細胞，與BMSC一樣，在恰當?shù)恼T導下，可分化成為脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、EC、上皮細胞、神經(jīng)細胞、肝細胞、胰島細胞、表皮細胞和真皮細胞等，表明其具有跨胚層、跨系分化的潛能。與BMSC相比，ASC具有以下優(yōu)點:脂肪組織儲量豐富，來源充足，組織獲取方法簡單，只需通過吸脂術等簡單的手術方法，不會給患者造成較大的疼痛和二次傷害，脂肪組織中干細胞含量豐富，比BMSC高出500倍，ASC增殖能力強，多次傳代后仍然保持遺傳性狀穩(wěn)定，具有較低的衰老程度，屬自體移植，無免疫排斥反應，不涉及醫(yī)學倫理學問題[29]。

目前脂肪干細胞在缺血性疾病中的應用研究已受到越來越多的關注，其中以缺血性心臟病和一些外周血管疾病尤甚。雖然目前脂肪干細胞的應用研究多停留在動物實驗階段，但已有一些臨床研究的早期結果表明，ASC應用于缺血性病變治療具有良好的效果。有研究者采用多點肌肉內(nèi)注射對15例下肢重度缺血的患者進行脂肪干細胞移植，在6個月的隨訪期間內(nèi)未出現(xiàn)并發(fā)癥，患者疼痛明顯緩解，間歇跛行距離明顯增加，臨床癥狀改善率達到66.7﹪。脂肪干細胞移植前后動脈造影顯示：細胞移植后大量的側枝血管建立[30]。

五、iPS細胞與血管新生

2006年Takahashi和Yamanaka[31]將小鼠的成纖維細胞誘導為iPS細胞。次年他們又利用4種同樣的轉(zhuǎn)錄因子將人的皮膚成纖維細胞誘導為iPS 細胞。2007年Tmson等篩選出了另外一套用于誘導的基因組合—Oct4、Sox2、Nanog、Lin28。隨后，他們利用這4種因子使人類新生兒成纖維細胞重構為iPS細胞。這兩項發(fā)現(xiàn)分別被《自然》和《科學》雜志評為2007年第一和第二大科學進展。2008年Schenke-Layland等[32]將鼠皮膚細胞重編程為iPS細胞，并成功地使其分化成心肌細胞、血管平滑肌細胞及造血細胞。

iPS細胞研究面臨的問題及應用前景：(1)效率問題。目前，誘導產(chǎn)生iPS細胞的效率仍然很低，這與基因?qū)氲姆绞?、整合位點和表觀遺傳學等多種因素有關。這已成為制約iPS由實驗室走向臨床的最大瓶頸。因此, 如何提高iPS細胞的制備效率仍是人們普遍關注的問題。(2)安全性問題?，F(xiàn)在誘導iPS細胞通常借助逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，將幾種癌基因轉(zhuǎn)入分化細胞誘導其成為iPS細胞，而這種方法就有可能會因為外源基因插入細胞基因組，干擾了內(nèi)源基因的表達,從而誘發(fā)癌癥。iPS細胞的安全性問題限制了其在臨床上的應用，建立高效、安全、實用的制備iPS細胞方法是目前研究的重點[33]。

目前iPS細胞在血管新生中的研究尚處于起步階段，有許多關鍵問題有待解決。但可以相信隨著iPS研究的進一步深入，iPS安全問題的有效控制，其將在血管新生過程中扮演越來越重要的角色。

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2013-03-19)

(本文編輯：陳媛媛)

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2013.02.001

北京市科技計劃項目(Z121100005512009)；北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術人才培養(yǎng)計劃—學科骨干(2009-3-59)；結構類組織的組織工程構建技術與產(chǎn)品研發(fā)(2012AA020507)；干細胞移植治療心力衰竭的臨床前評價和臨床研究 (2011AA020101)

首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院血管外科 首都醫(yī)科大學血管外科研究所

谷涌泉，Email：ydjiang202@yahoo.com.cn

谷涌泉，佟鑄.干細胞移植促進血管新生的研究進展[J/CD].中華細胞與干細胞雜志：電子版, 2013, 3(2):56-60.