朱蘇敏 馮亞東 金海林 施瑞華

[摘要] 目的 探討上皮細(xì)胞激酶與層黏連蛋白laminin 5-γ-2在食管鱗癌細(xì)胞株TE13中表達(dá)相關(guān)性。 方法 采用細(xì)胞免疫組化法檢測EphA2與laminin 5-γ-2在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TE13中的表達(dá)相關(guān)性；采用RT-PCR方法檢測EphA2與LN5-γ-2 mRNA表達(dá)的關(guān)系；采用Western Blot法檢測食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TE13中經(jīng)RNA干擾技術(shù)特異性沉默EphA2后LN5-γ-2蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果 細(xì)胞免疫組化結(jié)果顯示LN5-γ-2蛋白在細(xì)胞胞漿表達(dá)，且沉默EphA2后，LN5-γ-2表達(dá)減少。RT-PCR及Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TE13中，LN5-γ-2 mRNA及蛋白均隨EphA2的沉默而受抑制（P<0.05）。 結(jié)論 LN5-γ-2表達(dá)受EphA2的調(diào)控，可能為EphA2的靶基因。EphA2可能通過調(diào)控laminin5-γ-2對(duì)食管鱗癌腫瘤血管生成擬態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié)。

[關(guān)鍵詞] 食管鱗癌；上皮細(xì)胞激酶；層黏連蛋白5-γ-2

[中圖分類號(hào)] R735.1???[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A???[文章編號(hào)] 2095-0616（2012）21-39-03

The correlation of EphA2 and laminin 5-γ-2 in human esophageal cell TE13 line in vitro

ZHU?Sumin1??FENG?Yadong2??JIN?Hailin3??SHI?Ruihua2

1.Medical Center for Digestive Diseases，the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210011，China； 2.Department of Digestion，the First Affiliated Hospital of NJMU，Nanjing 210029，China； 3.Gastrointestinal Endoscopy Center，Jiangsu Provincial Hospital of TCM，Nanjing 210029，China

[Abstract] Objective To investigate the correlation of EphA2 and laminin 5-γ-2 in human esophageal cell TE13 line in vitro. Methods In the present study，human esophageal squamous cell carcinoma TE13 lines were examined for LN-5 expression immunohistochemically，using an antibody against LN-5-γ-2 chain.TE13 cell line with scilencing EphA2 gene were examined for LN-5-γ- 2?chain levels by Western blotting and RT-PCR. Results Laminin 5-γ-2 could be detected in cytoplasm in TE13 and the level of expression of lamanin 5-γ-2 decreased with silencing EphA2 immunohistochemically.RT-PCR and Western blot showed that the expression of laminin 5-γ-2 in TE13 was inhibited with silencing EphA2（P<0.05）. Conclusion The expression of laminin 5-γ-2 positively correlates with expression of EphA2.Laminin 5-γ-2 may be a potential target gene of EphA2.

[Key words] Esophageal squamous cell carcinoma；Epithelial cell kinase；Laminin 5-γ-2

我國是食管癌的高發(fā)區(qū)，研究食管癌的發(fā)病機(jī)制、提高早期診斷率、尋找新的治療途徑是食管癌防治的關(guān)鍵[1]。食管癌是生長迅速的腫瘤，因此食管癌組織內(nèi)常常存在著乏氧微環(huán)境。缺氧狀態(tài)可以刺激腫瘤細(xì)胞合成和分泌大量促血管生成因子如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等，促進(jìn)腫瘤血管的生成，促進(jìn)惡性腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移。血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種存在于高侵襲性腫瘤的血液供應(yīng)方式，是由腫瘤細(xì)胞通過自身變形和基質(zhì)重塑產(chǎn)生血管樣通道，并與宿主血管相連，使腫瘤獲得足夠血供的一種血管化途徑。VM的存在對(duì)腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移有著巨大影響，與惡性腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)[2-3]。層黏連蛋白（laminin，LN）是一種有多種生物學(xué)功能細(xì)胞外基質(zhì)的糖蛋白，它們?cè)诨啄さ臉?gòu)建及細(xì)胞粘附、生長、遷移和分化中扮演著至關(guān)重要的角色[4]。有研究顯示，層黏連蛋白的功能角色（5γ2鏈）在VM形成中發(fā)揮著重要功能[5]。細(xì)胞過表達(dá)血管生成2（angiopoie.tin-2）能使LN5-γ-2表達(dá)上調(diào)[6]。EphA2 是Eph亞家族成員中被發(fā)現(xiàn)的具有酪氨酸酶活性的第一個(gè)基因編碼產(chǎn)物，其功能涉及調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和遷移及血管生成。本研究組前期研究證實(shí)EphA2在食管鱗癌中是高表達(dá)的[7]，用EphA2 shRNA質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人食管鱗癌細(xì)胞株Eca-109和TE13細(xì)胞后，采用Matrigel體外三維培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在有氧和缺氧條件下，抑制EphA2表達(dá)均可使腫瘤細(xì)胞管腔形成數(shù)量明顯減少[8]。本研究從腫瘤血管生成擬態(tài)的關(guān)鍵因子LN入手，探討EphA2與LN之間的關(guān)系，初步探討腫瘤血管生成擬態(tài)的形成環(huán)節(jié)。

1?材料與方法

1.1?細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)

人低分化食管鱗癌細(xì)胞株TE13購自上海細(xì)胞所，本研究組已成功構(gòu)建EphA2shRNA質(zhì)粒pcDNA6.2-GW/EmGFP shRNA，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TE13細(xì)胞，獲得TE13 EphA2/Neo細(xì)胞株和TE13 EphA2/shRNA細(xì)胞株。所有細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37℃，5%CO2及飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2?主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司，鼠抗人EphA2購自R&D;公司，兔抗人laminin 5-γ-2抗體購自SantaCruz公司。ProteinA瓊脂糖珠購自Millipore公司。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑購自Fermentas公司。

1.3?逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測

TE13細(xì)胞、TE13EphA2/Neo細(xì)胞和TE13 EphA2/shRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后倒掉6孔板中的培液，每空加入1 mL的TRIZOL試劑，按照TRIZOL試劑的說明書抽提RNA。之后取1μg的RNA，按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的要求將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件為：37℃ 15 min，85℃ 15 s，4℃ +∞。引物設(shè)計(jì)由上海杰瑞生物工程有限公司完成，LN的引物為：上游引物5‘-TGAAGCGTAACCAGCCGACGC-3，下游引物5‘-CACAAACAGCACGTCCGGCTCT-3，以GAPDH為內(nèi)參，其上游引物為5‘-GGGCTCTCTGCTCCTCCCTGTT-3，下游引物為5‘-GCCGTTGAACTTGCCGTGG-GTAG-3。Q-PCR的條件為95℃ 5 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40 cycles，其中以evergreen為熒光染料。

1.4?細(xì)胞免疫組化

TE13細(xì)胞、TE13EphA2/Neo細(xì)胞和TE13 EphA2/shRNA細(xì)胞培養(yǎng)24 h，細(xì)胞以冰甲醇固定，兔抗人laminin 5-γ-2抗體工作濃度1∶200，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。DAB染色，光鏡下觀察細(xì)胞胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性。

1.5?Western Blot檢測

TE13細(xì)胞、TE13EphA2/Neo細(xì)胞和TE13 EphA2/shRNA細(xì)胞提取總蛋白，40μg蛋白上樣用5%濃縮膠、10%～15%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉37℃封閉1 h，分別與相應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜。PBST洗膜3次后與相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育2 h。ECL孵育3 min，暗室曝光并洗片。

1.6?統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SSPS11.0處理，均以（）表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?RT-QPCR檢測laminin5-γ-2 mRNA的表達(dá)

TE13 EphA2/shRNA細(xì)胞中的EphA2（灰度值0.12±0.01）和laminin5-γ-2mRNA（灰度值0.14±0.01）的表達(dá)水平明顯低于在TE13細(xì)胞（灰度值1，1）和TE13 EphA2/Neo細(xì)胞（灰度值0.99±0.01，0.98±0.01）中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。TE13細(xì)胞和TE13 EphA2/Neo細(xì)胞中EphA2和laminin5-γ-2mRNA的表達(dá)水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖1。

2.2?EphA2對(duì)laminin5-γ-2在TE13細(xì)胞中蛋白表達(dá)的影響

EphA2和laminin5-γ-2在TE13中均存在高表達(dá)。細(xì)胞免疫組化表明，laminin5-γ-2在TE13細(xì)胞和TE13 EphA2/Neo細(xì)胞胞漿內(nèi)呈陽性表達(dá)，而laminin5-γ-2在TE13 EphA2/shRNA細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于在TE13細(xì)胞和TE13 EphA2/Neo細(xì)胞中的表達(dá)。見圖2。Western Blot檢測表明，在TE13 EphA2/shRNA細(xì)胞中，EphA2（灰度值0.10±0.01）和laminin5-γ-2（灰度值0.01±0.00）的蛋白表達(dá)水平明顯低于在TE13細(xì)胞（灰度值1，1）和TE13 EphA2/Neo細(xì)胞（灰度值0.98±0.01，0.99±0.01）中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。TE13細(xì)胞和TE13 EphA2/Neo細(xì)胞中EphA2和laminin5-γ-2的蛋白表達(dá)水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖3。

3?討論

EphA2是Eph亞家族成員中被發(fā)現(xiàn)的具有酪氨酸酶活性的第一個(gè)基因編碼產(chǎn)物，是1990年Lindberg等[6]從人角化上皮細(xì)胞cDNA文庫中篩選得到的。EphA2廣泛表達(dá)于人類上皮來源的細(xì)胞，包括表皮、肺臟、腸道上皮細(xì)胞和卵巢組織等，其功能涉及調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和遷移及血管生成。近年來研究表明，EphA2 在許多腫瘤組織中呈高表達(dá)，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌和胃癌等[9-13]。同時(shí)臨床研究還發(fā)現(xiàn)EphA2的高表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[9-10]。本研究組前期研究也證實(shí)EphA2在食管鱗癌中高表達(dá)[7]，而且用EphA2 miRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人食管鱗癌細(xì)胞株Eca-109和TE13細(xì)胞后，采用Matrigel體外三維培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在有氧和乏氧條件下，抑制EphA2表達(dá)均可使腫瘤細(xì)胞管腔形成數(shù)量明顯減少[8]，提示EphA2與食管鱗癌的VM生成密切相關(guān)。

層黏連蛋白是一種有多種生物學(xué)功能細(xì)胞外基質(zhì)的糖蛋白，它們?cè)诨啄さ臉?gòu)建及細(xì)胞粘附、生長、遷移和分化中扮演著至關(guān)重要的角色[4]。LN-5是1987年Verrando等發(fā)現(xiàn)的，是一個(gè)由α3、β3、γ2三條多肽鏈經(jīng)二硫鍵結(jié)合的糖蛋白分子。層黏連蛋白-5的功能角色（γ2鏈）在VM形成中發(fā)揮著重要功能[14]。

血管生成擬態(tài)是近十年來腫瘤研究領(lǐng)域提出的新概念。與經(jīng)典的由內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的血管不同，它是由細(xì)胞外基質(zhì)和腫瘤細(xì)胞包繞著紅細(xì)胞而構(gòu)成的血管狀結(jié)構(gòu)。目前研究表明EphA2、LN5及VE-cadherin與血管生成擬態(tài)密切相關(guān)，筆者在前期研究中通過沉默VE-cadherin的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TE13細(xì)胞形成VM的能力下降，同時(shí)EphA2和laminin5-γ-2的蛋白表達(dá)水平也出現(xiàn)下降，可見VE-cadherin通過調(diào)節(jié)EphA2和laminin5-γ-2表達(dá)水平來影響TE13細(xì)胞形成VM的能力的[7]。在本研究中筆者發(fā)現(xiàn)在TE13 EphA2/shRNA細(xì)胞中，laminin5-γ-2在mRNA水平及蛋白水平上表達(dá)明顯較TE13細(xì)胞和TE13 EphA2/Neo細(xì)胞下降，這提示laminin5-γ-2可能接受EphA2的調(diào)控，是EphA2的下游基因。EphA2可能是通過調(diào)控laminin5-γ-2來對(duì)食管鱗癌腫瘤血管生成擬態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié)的。

綜上所述筆者發(fā)現(xiàn)，laminin5-γ-2可能接受EphA2的調(diào)控，是EphA2的下游基因。EphA2可能通過調(diào)控laminin5-γ-2來對(duì)食管鱗癌腫瘤血管生成擬態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié)。上述結(jié)果讓筆者對(duì)血管生成擬態(tài)的發(fā)生機(jī)制有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，為生物治療食管癌提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2012-09-11）