先天敏，陳介南，張 林

（中南林業(yè)科技大學(xué) 國家林業(yè)局生物乙醇研究中心，生物環(huán)境科學(xué)與技術(shù)研究所，湖南 長沙 410004）

黑曲霉改良株C112產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的誘導(dǎo)及條件優(yōu)化

先天敏，陳介南，張 林

（中南林業(yè)科技大學(xué) 國家林業(yè)局生物乙醇研究中心，生物環(huán)境科學(xué)與技術(shù)研究所，湖南 長沙 410004）

利用單因素實驗及均勻設(shè)計法研究了黑曲霉C112發(fā)酵產(chǎn)β- 葡萄糖苷酶的發(fā)酵條件。結(jié)果表明：黑曲霉

C112發(fā)酵產(chǎn)β- 葡萄糖苷酶的影響因素很多，包括接種方式(菌株活力)、接種量、碳氮源種類與濃度、發(fā)酵溫度時間、初始pH值等。研究發(fā)現(xiàn)，通過種子接種改善菌株活力能有效提高產(chǎn)酶活力。碳源粒徑也是影響誘導(dǎo)產(chǎn)酶效果的重要條件之一，當(dāng)玉米芯粒徑高于0.180 mm時產(chǎn)酶效果最佳。該菌株最適宜產(chǎn)酶條件為：玉米芯與麥芽浸粉（7:3）6 g/L、初始pH值4.87、30 ℃下發(fā)酵120 h，所得酶活力最大可達(dá)12.925 U/mL，較優(yōu)化前提高了79.0 %。

黑曲霉；發(fā)酵 β-葡萄糖苷酶；條件優(yōu)化；麥芽浸粉

生物燃料乙醇可以替代石油等化石能源,是發(fā)展低碳經(jīng)濟(jì)的重要新能源[1]。以纖維素為原料生產(chǎn)燃料乙醇具有低污染、可再生、農(nóng)林纖維素資源廣泛等優(yōu)點，前景可觀[2]。目前，生物乙醇的生產(chǎn)方式是通過纖維素酶復(fù)合酶系降解纖維素成為葡萄糖單體。β-葡萄糖苷酶，編號EC3.2.1.21，英文名β-glucosidase，是纖維素酶復(fù)合酶系的重要組成部分[3]。其功能是水解纖維二糖和短鏈的纖維寡糖生成葡萄糖，解除中間產(chǎn)物纖維二糖對纖維素酶復(fù)合酶系中內(nèi)切葡聚糖水解酶和外切葡聚糖水解酶的抑制。內(nèi)切葡聚糖水解酶和外切葡聚糖水解酶必須與β-葡萄糖苷酶充分協(xié)同才能完成纖維素的有效降解。

目前所報道的木霉屬纖維素酶生產(chǎn)菌株普遍呈現(xiàn)出低β-葡萄糖苷酶活的特點[4]。劉杰鳳[5]等曾報道一株纖維素高產(chǎn)菌株，其最優(yōu)產(chǎn)酶結(jié)果如下：β-葡萄糖苷酶酶活324 U/g， FPA（濾紙酶活）1 227 U/g，兩者比率僅為0.264。而Gupta[6]等曾報道，在濾紙酶中添加9.0 IU /g的β-葡萄糖苷酶，能使纖維類物質(zhì)的酶解糖化效率最高。本實驗室的研究[7-8]也顯示，通過優(yōu)化調(diào)整β-葡萄糖苷酶與濾紙酶的比為1.39時，酶解糖化率最高。因此，在木霉屬纖維素酶中額外添加β-葡萄糖苷酶是提高纖維素酶系降解能力的重要途徑之一[9-10]。此外，β-葡萄糖苷酶在食品[11]、釀酒[12]、化學(xué)工業(yè)[13-14]等大量領(lǐng)域都有所運用。

目前，β-葡萄糖苷酶主要源于黑曲霉等菌種的發(fā)酵。黑曲霉是公認(rèn)安全(GRAS)的微生物，生長快，發(fā)酵周期短,其生產(chǎn)所得酶制劑安全，可靠，無毒素。黑曲霉C112是本實驗室由黑曲霉30786原始菌株（購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心）誘變而來，具有相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)酶潛力，已知的最大酶活為7.220 U/mL[15]。

本文通過單因素實驗和均勻?qū)嶒瀃16]對黑曲霉C112產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的液體發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，試圖降低生產(chǎn)成本，獲得高產(chǎn)量的β-葡萄糖苷酶。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

黑曲霉Aspergillus niger C112，是本實驗室誘變選育的β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株[11]。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體平板培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基[17]。種子培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基[13]。發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基[11]：麩皮10 g/L，酵母粉 5 g/L，硫酸銨 2.8g/L，KH2(PO4) 4 g/L，MgSO4·7H2O0.9 g/L，CaCl20.9 g/L，吐溫2滴/瓶，起始pH 5.0。

1.1.3 主要的儀器設(shè)備

島津UV-5420紫外分光光度計，Hirayama高 壓 滅 菌 鍋HVE-50，Mettler Toledo pH計，Eppendorf單道移液器，單人超凈工作臺，制冰機(jī)，101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱，SPX-250B生化培養(yǎng)箱，760R恒溫?fù)u床等。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的基礎(chǔ)培養(yǎng)方法

平板培養(yǎng)：28 ℃培養(yǎng)5 d。

發(fā)酵培養(yǎng)[11]：從黑曲霉固體平板培養(yǎng)基上挑取一環(huán)孢子，接種于裝液100 mL的產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，28 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)5 d。所有搖瓶實驗均為3個平行。

1.2.2 粗酶液制備

發(fā)酵培養(yǎng)液在4 500 r /min離心7 min，取上清液為粗酶液。

1.2.3 β-葡萄糖苷酶的活力測定

采用國際通用的方法測定β-葡萄糖苷酶的活力[18-19]：取0.1 mL稀釋了適當(dāng)倍數(shù)的粗酶液（空白管不加），加入1 mLpH4.8的0.05 mol/L檸檬酸緩沖溶液，于50℃水浴預(yù)熱10 min；加入已預(yù)熱10 min的0.9 mL5 mmol/L p-NPG溶液，計時，10 min后立即加入1 mL 1 mol/LNa2CO3溶液終止反應(yīng)；加入蒸餾水定容到25 mL；室溫放置5 min，于410 nm處測吸光度值A(chǔ)。在上述條件下，1 mL酶液1 min水解產(chǎn)生1 μmol的對硝基苯酚的酶活力，定義為一個酶活單位。

β-葡萄糖苷酶活力按式1計算。

式中：Y1為樣品的β-葡萄糖苷酶活力，U/mL·min；A 為根據(jù)吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的對硝基苯酚量，μmol；N 為粗酶液的稀釋倍數(shù)，本實驗中，該值為1（未稀釋）；1/(0.1 mL×10 min) —換算成酶液1 mL反應(yīng)1 min。

對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：配制10 mmol/L對硝基苯酚母液，分別吸取0.025, 0.050, 0.075, 0.100，0.125, 0.150 mL母液，加入1 mL 1 mol/L Na2CO3溶液顯色加入蒸餾水定容到25 mL，于410 nm處測吸光度值A(chǔ)。其分別對應(yīng)的對硝基苯酚的量為0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50 μmol。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 對硝基苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of p-nitrophenol

1.3 單因素實驗

1.3.1 種子接種對產(chǎn)酶的影響

挑取一環(huán)孢子，接種于100 mL的種子培養(yǎng)基，28 ℃，200 r/min，培養(yǎng)60 h得菌絲體種子液。以孢子接種產(chǎn)酶作為對照組，實驗組種子液接種量分別為1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%。在28 ℃，200 r/min，培養(yǎng)5 d ,進(jìn)行β-葡萄糖苷酶的活力測定。

1.3.2 種子培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響

挑取一環(huán)孢子，接種于100 mL的種子培養(yǎng)基，28℃，200 r/min， 分 別 培 養(yǎng) 24、36、48、60、72、84、96 h得菌絲體種子液，均以5%的接種量接種于發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在28 ℃，200 r/min，培養(yǎng)5 d，進(jìn)行β-葡萄糖苷酶的活力測定。

1.3.3 碳源對產(chǎn)酶的影響

以發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照。在去掉麩皮的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加10 g/L的9種不同碳源，包括麩皮、稻草粉、甘蔗渣、糠、美國松、玉米芯、工業(yè)纖維素、可溶性淀粉、蔗糖；在28 ℃，200 r/min，培養(yǎng)5 d，進(jìn)行β-葡萄糖苷酶的活力測定。

1.3.4 碳源粒徑對產(chǎn)酶的影響

將適度粉碎后的玉米芯依次過18目（1.00 mm）和80目(0.180 mm)篩。不能通過18目篩的玉米芯顆粒為1號樣本，通過18目篩但不能通過80目篩的為2號樣本，通過50目篩的為3號樣本。將適度粉碎的后的稻草粉依次過18目和80目篩，同樣由大粒徑至小粒徑依次編為4號樣本，5號樣本，6號樣本。在去掉麩皮的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加10 g/L的6種碳源樣本,在28 ℃，200 r/min，培養(yǎng)5 d ，進(jìn)行β-葡萄糖苷酶的活力測定。

1.3.5 附加碳源種類對產(chǎn)酶的影響

在去掉麩皮的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入7 g/L的玉米芯作為基礎(chǔ)碳源。以3 g/L的量分別加入12種有機(jī)物作為附加碳源，包括麥芽浸粉、工業(yè)纖維素、淀粉、麩皮、稻草粉、葡萄糖、米糠、木糖、甘蔗渣、蔗糖、麥芽糖、乳糖。在28 ℃，200 r/min，培養(yǎng)5 d，進(jìn)行β-葡萄糖苷酶的活力測定。

1.3.6 碳源濃度對產(chǎn)酶的影響

在去掉麩皮的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入5，10，15，20，25 g/L的玉米芯與麥芽浸粉（7:3）的混合碳源，在28 ℃，200 r/min，培養(yǎng)5 d ,進(jìn)行β-葡萄糖苷酶的活力測定。

1.3.7 不同氮源對產(chǎn)酶的影響

在去掉氮源的產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入2.8 g/L的不同氮源，包括硫酸銨、硝酸銨、蛋白胨、尿素、硫酸銨與硝酸鈉（1:1）、硫酸銨與尿素（1:1）、硫酸銨與蛋白胨（1:1）。于28 ℃，200 r/min，培養(yǎng)5 d，進(jìn)行β-葡萄糖苷酶的活力測定。

1.3.8 產(chǎn)酶溫度及時長對產(chǎn)酶的影響

保持培養(yǎng)基成分不變，接種產(chǎn)酶培養(yǎng)基后分別在26，28，30 ℃下培養(yǎng)144 h，每個溫度條件下3個平行。所有樣品均在72，96，120，144 h進(jìn)行取樣，進(jìn)行β-葡萄糖苷酶的活力測定。

1.3.9 pH對產(chǎn)酶的影響

保持培養(yǎng)基成分不變，使用1 mol/L的HCl溶液和1 mol/L 的NaOH溶液將培養(yǎng)基的初始pH值分別調(diào)成4、4.5、5、5.5、6、6.5、7。發(fā)酵溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)數(shù)200 r/min，發(fā)酵120 h后測定β-葡萄糖苷酶活。

1.4 均勻?qū)嶒瀃12]

本實驗選了對發(fā)酵結(jié)果影響較大的五個因素：接種量、碳源濃度、初始pH值、發(fā)酵溫度、裝液量作為考察對象。其中接種量和碳源濃度,設(shè)置10個水平；發(fā)酵料初始pH值、發(fā)酵溫度和裝液量各設(shè)置5個水平。具體試驗設(shè)計見表1。

表1 黑曲霉C112發(fā)酵配方的優(yōu)化試驗因素水平分配方案Table 1 Optimization test factors allocation plan for fermented recipes of Aspergillus niger C112

選取U*10 ( 108) 均勻設(shè)計表，根據(jù)其使用表的規(guī)定，選擇表中的第1列、第2列、第4列、第5列、第7列，用擬水平法構(gòu)造。再把每列的水平代碼換成相應(yīng)因素的水平值，即得到試驗方案，試驗的安排見表2。

表2 試驗方案與結(jié)果Table 2 Testing program and results

按實驗安排表進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，測定β-葡萄糖苷酶的活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 種子接種對產(chǎn)酶的影響

種子接種對產(chǎn)酶的影響見圖2。由圖2可知，隨著接種量的增加，β-葡萄糖苷酶活力先升高再下降。當(dāng)黑曲霉C112以6 %的種子液進(jìn)行接種時，β-葡萄糖苷酶活力達(dá)到7.305 U/mL，而對照組β-葡萄糖苷酶活力僅為3.759 U/mL?？芍N子接種法效果優(yōu)于孢子接種法。因此，本文選擇了6%的接種量進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 種子接種對產(chǎn)酶的影響Fig. 2 Effects of inoculation of seeds on enzyme production

2.1.2 種子培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響

種子培養(yǎng)時間通過影響接種時的菌體活性強(qiáng)弱，最終影響產(chǎn)酶量。種子培養(yǎng)時間對黑曲霉C112產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力的影響見圖3，隨著種子培養(yǎng)時間的延長，β-葡萄糖苷酶活力先升高再下降，符合黑曲霉的菌體生長規(guī)律。黑曲霉當(dāng)種子培養(yǎng)達(dá)到60 h時，β-葡萄糖苷酶活力最高，為7.957 U/mL。

圖3 種子培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響Fig. 3 Effects of seed culture on enzyme production

2.1.3 碳源對產(chǎn)酶的影響

β-葡萄糖苷酶屬于誘導(dǎo)酶類，碳源通常是該酶合成的誘導(dǎo)物質(zhì)[3]。不同碳源誘導(dǎo)黑曲霉合成β-葡萄糖苷酶的能力不同。碳源種類對產(chǎn)酶的影響見圖4。由圖4可知，麩皮、稻草粉、甘蔗渣、玉米芯、工業(yè)纖維素等纖維性碳源的誘導(dǎo)產(chǎn)酶能力高于可溶性淀粉、蔗糖等可溶性碳源。尤其在玉米芯中產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的活力最高。

圖4 碳源對產(chǎn)酶的影響Fig. 4 Effects of carbon sources on enzyme production

2.1.4 碳源粒徑對產(chǎn)酶的影響

黑曲霉C112對不同種類粒徑的碳源具有不同的吸收能力，從而影響產(chǎn)酶效果。碳源粒徑對產(chǎn)酶的影響見圖5。由圖5可知，當(dāng)玉米芯粒徑大于0.180 mm時，粒徑變化對產(chǎn)酶活性影響有限。當(dāng)玉米芯粒徑小于0.180 mm時，誘導(dǎo)產(chǎn)酶的能力大幅度降低，僅達(dá)4.32 U/mL。其原因可能是粒徑過低導(dǎo)致的菌體與顆粒接觸不良。而稻草粉則由于長徑比較大，產(chǎn)酶能力在試驗范圍內(nèi)隨粒徑的減小而增加，在粒徑小于0.180 mm時，達(dá)到最大產(chǎn)酶活力6.069 U/mL。其原因可能是在低粒徑下，稻草中的長纖維束被切割為較短的纖維束，更容易被菌體分解。因此，本文選擇了1號樣本進(jìn)行后續(xù)研究。

圖5 碳源粒徑對產(chǎn)酶的影響Fig. 5 Effects of carbon sources grain diameter on enzyme production

2.1.5 附加碳源對產(chǎn)酶的影響

附加碳源對產(chǎn)酶的影響見圖6。由圖6可知，麩皮、麥芽浸粉作為附加碳源，能有效提高酶活，分別可達(dá)10.517 U/mL和10.786 U/mL。麥芽浸粉對產(chǎn)酶的誘導(dǎo)作用可能是由于其富含的多種單糖、低聚糖及生長因子引起的，更有利于菌體的利用。而淀粉、蔗糖等可溶性附加碳源對β-葡萄糖苷酶的合成存在一定的抑制作用。工業(yè)纖維素引起的酶活降低則可能是由纖維聚合度過高不利于菌體利用引起的[20]。因此，本文選擇了7 g/L玉米芯，3 g/L麥芽浸粉做為碳源進(jìn)行后續(xù)研究。

圖6 附加碳源對產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effects of additional carbon sources on enzyme production

2.1.6 碳源濃度對產(chǎn)酶的影響

碳源含量影響菌體的生長情況及產(chǎn)酶量。碳源濃度對產(chǎn)酶的影響見圖7，β-葡萄糖苷酶酶活力隨著碳源濃度的升高而升高，當(dāng)碳源濃度為25 g/L時，β-葡萄糖苷酶酶活最高，為10.910 U/mL。同的吸收能力，從而影響產(chǎn)酶效果。不同氮源對產(chǎn)酶的影響見圖8。由圖8可知，無機(jī)氮源的產(chǎn)酶能力優(yōu)于有機(jī)氮源，單一氮源的產(chǎn)酶能力優(yōu)于復(fù)合氮源。菌株在硫酸銨中產(chǎn)出的β-葡萄糖苷酶活力最強(qiáng)。

圖7 碳源濃度對產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effects of carbon sources concentration on enzyme production

圖8 氮源對產(chǎn)酶的影響Fig. 8 Effects of nitrogen source on enzyme production

2.1.7 不同氮源對產(chǎn)酶的影響

黑曲霉C112對不同種類、性質(zhì)的氮源具有不

2.1.8 產(chǎn)酶溫度及時長對產(chǎn)酶的影響

時間溫度對產(chǎn)酶的影響見圖9。由圖9可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，β-葡萄糖苷酶活力普遍先上升后下降。酶活的下降可能與代謝廢物的積累有關(guān)。菌株在28 ℃下在不同時間測定的酶活值均高于其他溫度，是黑曲霉C112的較適產(chǎn)酶溫度。在該溫度下發(fā)酵120 h達(dá)到酶活最高值，為10.566 U/mL。

圖9 溫度時間對產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effects of temperature and time on enzyme production

2.1.8 pH值對產(chǎn)酶的影響

pH值對產(chǎn)酶的影響見圖10。由圖10可知，隨著發(fā)酵初始pH值的升高，β-葡萄糖苷酶活力普遍先上升后下降。當(dāng)初始pH為5時，β-葡萄糖苷酶活力最高，達(dá)到8.564 U/mL。該現(xiàn)象的原因可能是不適宜的pH值抑制菌體內(nèi)某些酶的活性, 使菌的新陳代謝受阻。極端pH條件也有可能導(dǎo)致分泌至胞外的β-葡萄糖苷酶失活。

圖10 初始pH值對產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effects of initial pH values on enzyme production

2.2 均勻?qū)嶒?/h3>

2.2.1 均勻?qū)嶒灲Y(jié)果見表3。

2.2.2 數(shù)據(jù)分析及模型建立

采用直觀分析法，由表3可以看出，最好的條件是實驗組中第5號。結(jié)果為11.297 U/mL。

表3 均勻試驗方案與結(jié)果Table 3 Uniform test program and results

采用回歸分析對均勻設(shè)計結(jié)果進(jìn)行深入分析。參數(shù)估計如下：試驗次數(shù)n=10，因素數(shù)m= 5。 用最小二乘法求出五元線性回歸方程：

式中：X1為接種量，X2為碳源濃度，X3為初始pH，X4為發(fā)酵溫度，X5為裝液量，Y為酶活。

進(jìn)行方程的顯著性檢驗（F檢驗）：F=MSR/MSe=7.869 服從自由度為(5,4)的F分布，在給定的顯著性水平a=0.05下，查表可得，F(xiàn)0.05(5,4)=6.26。F＞F0.05( 5,4)。根據(jù)F檢驗，方程有顯著的線性關(guān)系。

擬合效果檢驗( R 檢驗)。R2=0.987，說明該多元線性模型在99.95%的水平下擬合的很好，方程的總體線性關(guān)系是顯著的。方差分析見表4。

表4 方差分析Table 4 Variance analysis

對回歸方程局部求最優(yōu)解，得到在接種量4.26 %，碳源濃度27.5 g/L，pH4.87，30 ℃，裝液量60 ml時可能產(chǎn)生較高酶活。

對回歸方程中的一次項系數(shù)進(jìn)行比較，可知各因素對β-葡萄糖苷酶活力的影響主次性順序為：碳源濃度＞接種量＞發(fā)酵溫度＞裝液量＞初始pH。

由于β-葡萄糖苷酶活力隨碳源濃度的增加而增加，為了得到更好的結(jié)果，可以對上述工藝條件做進(jìn)一步改良。在驗證試驗中可以適當(dāng)增加碳源濃度。

2.3 驗證結(jié)果

為了驗證黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的模型的適用性，在4.26 %的接種量，27.5 g/L碳源，pH值4.87，30℃，裝液量60 mL時進(jìn)行驗證試驗，重復(fù)6次，得出β-葡萄糖苷酶的平均酶活為11.417 U/mL。

適當(dāng)增加碳源濃度，驗證后結(jié)果如下：當(dāng)碳源濃度分別為50.0 g/L及60.0 g/L時，β-葡萄糖苷酶酶活為11.852 U/mL及12.925 U/mL，較未優(yōu)化前實驗室的最優(yōu)水平7.220 U/ml提高了79.0%。

3 結(jié) 論

目前，國內(nèi)外大多利用木霉屬所產(chǎn)纖維素酶分解木質(zhì)纖維生產(chǎn)生物燃料乙醇。但木霉屬產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性普遍偏低，限制了總體纖維素酶的酶解效率。通過向木霉屬所產(chǎn)纖維素酶中添加額外的β-葡萄糖苷酶可以有效提高總纖維素酶系的活性。本實驗對黑曲霉C112產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的工藝進(jìn)行了一系列的優(yōu)化，試圖降低該酶的生產(chǎn)成本。

由接種方式、種子培養(yǎng)時間、碳源種類及粒徑、附加碳源等單因素實驗的優(yōu)化結(jié)果可知：以6%的菌絲體種子液對產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行接種能有效提高黑曲霉C112產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力。使用玉米芯做碳源并控制其粒徑大于0.180 mm時產(chǎn)酶效果最佳。麥芽浸粉和麩皮作為附加碳源均對黑曲霉C112產(chǎn)β-葡萄糖苷酶均具有一定誘導(dǎo)作用。

均勻設(shè)計法可快速有效地確定多因子系統(tǒng)的優(yōu)化條件。由分析得出產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的最佳條件：接種量4.26 %，碳源濃度27.5 g/L，初始pH4.87，30 ℃，裝液量60 ml。在此產(chǎn)酶條件下，β-葡萄糖苷酶的平均酶活為11.417 U/mL。提高碳源濃度到60 g/L，即玉米芯42 g/L，麥芽浸粉18 g/L時，β-葡萄糖苷酶活力可達(dá)12.925 U/mL，較初始值7.220 U/mL提高了79 %。已報道的液體發(fā)酵較高酶活水平（采用相同的酶活測定方法）如下：劉長江[21]等利用一株β-葡萄糖苷酶基因工程菌，發(fā)酵產(chǎn)酶能力最高達(dá)到147.8 U/L；許曉鵬[22]等經(jīng)X射線誘變一株黑曲霉，發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶所得最大酶活為59.86 U/mL·h。本實驗所得的β-葡萄糖苷酶生產(chǎn)工藝處于較優(yōu)水平。在實際生產(chǎn)方案中可以考慮消耗和成本，來適當(dāng)調(diào)整碳源濃度的取值。若考慮產(chǎn)酶過程中的時間溫度分段控制，則能進(jìn)一步縮短產(chǎn)酶時間，降低生產(chǎn)成本。

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Induction and optimization of conditions for producing β-glucosidase by the improved strain Aspergillus niger C112

XIAN Tian-min, CHEN Jie-nan, ZHANG Lin
(Bio-ethanol Research Center of State Administration of Forestry, Institute of Biological and Environmental Science & Technology,Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

∶ Single factor experiment method and uniform design methodology were applied to optimize the fermentation of Aspergillus niger C112 for β-glucosidase. Many factors affected the fermentation of β-glucosidase, including the inoculation method (the vitality of strains), inoculum concentration, type and concentration of carbon and nitrogen sources, fermentation time and temperature, and initial pH, et al. The results show that the seed inoculation effectively improved the strains vitality and thus raising the enzyme production capacity; One of important factors which affected the enzyme production was the carbon particle size; Higher β-glucosidase activity was obtained when corn-core particle diameter was greater than 0.180 mm; The optimal fermentation conditions were as follows: corncore 42 g/L, malt extract 18 g/L, initial pH 4.87, cultivation for 120 hours under the temperature of 30 ℃. With the optimal fermentation conditions, the ultimate β-glucosidase activity reached to 12.925 U/mL，increasing by 79.0 % than before.

∶ Aspergillus niger; fermentation β-glucosidase; optimal conditions; malt extract

S718.43；S718.52+1.3

A

1673-923X(2013)11-0154-08

2013-08-16

國家948項目“高活性纖維素酶菌株產(chǎn)酶優(yōu)化技術(shù)引進(jìn)”（2012-4-10）；湖南省科技廳重點項目“木質(zhì)纖維轉(zhuǎn)化燃料乙醇高活性纖維素酶技術(shù)引進(jìn)”（2011WK2001）；國家公益性行業(yè)科研專項 “新型木本生物質(zhì)能源資源培育及開發(fā)利用研究”（201004001）；常德市科技局項目“木質(zhì)纖維轉(zhuǎn)化燃料醇高活性纖維酶技術(shù)引進(jìn)”（2011GK06）

先天敏（1988-），女，四川成都人，碩士研究生，研究方向細(xì)胞生物學(xué)；E-mail：296790953@qq.com

陳介南（1961-），男，湖南安化人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為生物能源、生物環(huán)境、生物納米的研究；E-mail：chenjnx@gmail.com

[本文編校：吳 毅]