孫筱，何璇，黃建耿，李高，斯陸勤 （華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，湖北 武漢430074）

福辛普利（fosinopril，又名蒙諾 Monopril）為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI），臨床上常用于治療高血壓和充血性心力衰竭（CHF）。福辛普利幾乎不溶于水，多用其鈉鹽以增加藥物溶解度，但口服生物利用度也僅為32%～36%［1］。有報(bào)道，福辛普利是H＋依賴的寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)體 Pept1 （H＋／peptide cotransporter）的底物［2］，Pept1的轉(zhuǎn)運(yùn)功能可能與其口服吸收密切相關(guān)。因此，深入了解福辛普利鈉在大鼠腸道的吸收特性，對(duì)其新劑型的開發(fā)和制劑處方設(shè)計(jì)具有重要意義。本文擬建立測定大鼠腸灌流液中福辛普利鈉含量的HPLC方法，并采用大鼠小腸單向灌流法考察福辛普利鈉在大鼠腸道的吸收特性，探討該藥物吸收與Pept1之間的關(guān)系。

1 材料

1．1 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Sepu3000工作站（杭州普惠科技有限公司）；TG16 W微量高速離心機(jī)（長沙平凡儀器儀表有限公司）；DF－101s集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南省予華儀器有限公司）；多通道蠕動(dòng)泵（德國Petro Gas Ausrüstungen Berlin公司）；DELTA320－pH計(jì)（上海梅特勒－托利多有限公司）。

1．2 試劑 福辛普利鈉（武漢圣天宇科技有限公司，純度＞99．6%，批號(hào)20101223）；甘氨酰肌氨酸（Gly－Sar，Sigma 公 司，純 度 ＞ 95%，批 號(hào)100952752）；烏拉糖（中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司）；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1．3 動(dòng)物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量（250±50）g，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（鄂）2004－0007。

2 方法

2．1 分析方法的建立

2．1．1 色譜條件 色譜柱：Eurospher C18柱（250 mm×4．0mm，5μm），預(yù)柱：C18保護(hù)柱（25 mm×4．6 mm，10μm），流動(dòng)相：乙腈－水（30∶70，其中水相含0．3% 三乙胺，pH 值為 2．2）；檢測波長：215 nm，流速：1．0mL·min－1，柱溫：40℃，進(jìn)樣量：20μL。

2．1．2 方法專屬性 取空白腸灌流液、福辛普利鈉對(duì)照品溶液及實(shí)際灌流液樣品考察腸液中各成分對(duì)福辛普利鈉的測定是否有干擾。

2．1．3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取福辛普利鈉對(duì)照品適量于量瓶中，用甲醇溶解得福辛普利鈉母液（4 mg·mL－1），分別取母液適量用空白腸灌流液稀釋成終濃度為2．5，5，10，20，40，80μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，并按“2．2．2”項(xiàng)下所述處理后進(jìn)行 HPLC分析。以福辛普利鈉濃度C為橫坐標(biāo)，藥物峰面積A為縱坐標(biāo)，采用最小二乘法進(jìn)行回歸計(jì)算，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

2．1．4 定量下限試驗(yàn) 福辛普利鈉母液用空白腸灌流液稀釋成終質(zhì)量濃度為2．5μg·mL－1的樣品，并按“2．2．2”項(xiàng)所述平行處理5份樣品，進(jìn)行HPLC分析，并根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的測得濃度，計(jì)算相對(duì)誤差（RE%）。

2．1．5 精密度和回收率試驗(yàn) 福辛普利鈉母液用空白腸灌流液稀釋成終質(zhì)量濃度分別為5，20，40 μg·mL－1的樣品，各取5份樣品，按“2．2．2”項(xiàng)所述平行處理，連續(xù)測定3 d，以當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的測得濃度。計(jì)算日內(nèi)精密度和日間精密度以及方法回收率和樣品提取回收率。

2．1．6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 福辛普利鈉母液用空白腸灌流液稀釋成終質(zhì)量濃度分別為5，20，40μg·mL－1的樣品，按“2．2．2”項(xiàng)所述平行處理5份樣品。各濃度樣品處理后于室溫放置8 h、置－20℃ 凍存1 d以及37℃ 水浴4 h后分別測定，并根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含藥樣品的測得濃度，計(jì)算放置前后的相對(duì)誤差。

2．2 大鼠小腸在體單向灌流試驗(yàn)

2．2．1 試驗(yàn)方法［3－5］大鼠禁食過夜，麻醉后打開腹腔，結(jié)扎膽管，分別在十二指腸、空腸、回腸兩端插管，結(jié)扎。用K－R液（氯化鈉7．0g，葡萄糖1．8 g，碳酸氫鈉1．26 g，磷酸二氫鈉0．234 g，磷酸氫二鈉0．252 g，氯化鉀0．34 g，氯化鎂0．05 g，置1 L量瓶中，純化水溶解并定容至刻度，0．1 mol·L－1鹽酸調(diào)pH值為7．4）配制的藥液平衡腸道30 min后，進(jìn)口處用己知質(zhì)量的裝有供試液的小瓶灌流、出口處用己知質(zhì)量的小瓶收集流出液，每10 min迅速更換供試、收集小瓶，稱重，計(jì)算灌入液和收集液質(zhì)量，試驗(yàn)共進(jìn)行90 min，整個(gè)試驗(yàn)過程保持0．25 mL·min－1左右的恒定速度灌流。試驗(yàn)結(jié)束后，測量并記錄所灌腸段的長度和內(nèi)徑。

試驗(yàn)考察的分腸段區(qū)間如下：十二指腸段自幽門1 cm處開始，空腸段離幽門15 cm開始，回腸段自盲腸上行20 cm開始，各分腸段均取約10 cm。

2．2．2 灌流樣品的處理方法 取大鼠腸灌流液100μL，加入甲醇200μL，渦混3 min，13 000 r·min－1離心15 min，取上清液進(jìn)樣測定。

2．2．3 藥物吸附性考察 配制含藥40μg·mL－1的灌流液，同 “2．2．1”項(xiàng)試驗(yàn)方法但不插管大鼠腸段灌流連接管路2 h，比較灌流前后的藥液濃度，考察試驗(yàn)管路和玻璃瓶對(duì)藥物的吸附性。

2．2．4 腸道滲透系數(shù)Peff計(jì)算公式［6－7］依據(jù)下式計(jì)算藥物的腸道有效滲透系數(shù)Peff：

其中，Qin為灌流液流入的流速（mL·s－1），Cout和Cin分別為腸道流出液、流入液的質(zhì)量濃度（μg·mL－1），S為灌流腸段的內(nèi)表面積（cm2），Vin和Vout分別為流入和流出的灌流液體積（mL），L為實(shí)驗(yàn)?zāi)c段的長度（cm），R為腸段半徑（cm）。

2．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)均以±s表示。通過SPSS軟件，多組間的比較采用ANOVA單因素方差分析；對(duì)兩組間的比較采用雙尾不配對(duì)的Student’st檢驗(yàn)。P＜0．05時(shí)，認(rèn)為差異有顯著性。

3 結(jié)果

3．1 HPLC方法的建立

3．1．1 方法專屬性試驗(yàn) 圖1結(jié)果顯示藥物峰形良好，無腸液內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。

圖1 福辛普利鈉HPLC專屬性考察圖譜Fig 1 HPLC specificity chromatograms of fosinopril sodium

3．1．2 線性關(guān)系考察 福辛普利鈉的線性回歸方程為Y＝9 440．7X－13 513，r＝0．999 2，福辛普利鈉在2．5～80μg·mL－1范圍內(nèi)線性良好。

3．1．3 定量下限 福辛普利鈉在定量下限為2．5 μg·mL－1時(shí)RSD小于5%，RE＜15%。

3．1．4 精密度及回收率 福辛普利鈉低、中、高濃度樣品的日內(nèi)精密度RSD值均小于3%，日間精密度RSD值均小于9%，低、中、高3個(gè)濃度的樣品方法回收率分別為 92．39%、96．58%、102．10%，提取回收率分別為 94．15%、97．19%、103．20%。見表1和表2。

3．1．5 穩(wěn)定性 低、中、高濃度的樣品處理后室溫放置8 h、未處理樣品 －20℃ 凍存1 d、37℃ 水浴4 h后藥物均無顯著變化，可準(zhǔn)確測定。見表3。

表1 福辛普利鈉精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of precision test of fosinopril sodium

表2 福辛普利鈉的回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab 2 Recovery rate of fosinopril sodium（n＝5）

3．2 藥物吸附性考察 灌流管路2 h后藥物濃度為初始濃度的（101．1±2．0）%，表明試驗(yàn)管路和小瓶對(duì)藥物無吸附作用。

3．3 福辛普利鈉在大鼠不同腸段的吸收 用空白K－R液（pH7．4）配制40μg·mL－1的含藥灌流液，按照“2．2．1”項(xiàng)下方法進(jìn)行灌流，福辛普利鈉在十二指腸、空腸和回腸的有效滲透系數(shù)Peff（×10－4cm·s－1，n＝6）分 別為 （1．5±0．4）、（1．15±0．26）和（0．91±0．14），且空腸和回腸與十二指腸之間差異均存在顯著性（P＜0．05）。

3．4 灌流液pH值對(duì)福辛普利鈉腸道吸收的影響分別配制pH 值為7．4，6．6，5．6的含藥溶液進(jìn)行灌流，結(jié)果見圖2。福辛普利鈉在不同腸段的滲透系數(shù)隨灌流液pH值下降而增加；當(dāng)pH值為5．6時(shí)，藥物在各腸段的吸收與福辛普利鈉在pH7．4時(shí)相比差異均有顯著性（P＜0．05）。

3．5 不同濃度Gly－Sar對(duì)福辛普利鈉腸道吸收的影響 Pept1的典型底物Gly－Sar對(duì)福辛普利鈉腸道吸收的影響見圖3。當(dāng)二肽濃度為0．144 mmol·L－1時(shí)，對(duì)藥物在十二指腸的吸收有極顯著性促進(jìn)作用（P＜0．01），但如進(jìn)一步提高二肽濃度，則藥物的吸收呈下降趨勢，當(dāng)濃度為3．59 mmol·L－1時(shí)，三段腸對(duì)藥物的吸收與0．072 mmol·L－1或0．144 mmol·L－1時(shí)相比均出現(xiàn)顯著性差異（P＜0．05）。

表3 福辛普利鈉穩(wěn)定性試驗(yàn)（n＝5）Tab 3 Stability of fosinopril sodium（n＝5）

4 討論

由于福辛普利鈉的最大紫外吸收處于較低波長處，其生物樣品的測定易受內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾。在預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，腸灌流液樣品采用甲醇沉淀蛋白后雜質(zhì)峰可明顯少于乙腈；降低流動(dòng)相的pH值可顯著改善峰型，但同時(shí)會(huì)使雜質(zhì)峰增加；此外，加入適量的三乙胺也可顯著改善藥物峰型。采用本文所建立的HPLC條件對(duì)福辛普利鈉大鼠腸灌流液進(jìn)行測定，其方法簡單、靈敏、可靠，精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性均可滿足生物樣品測定的要求。

福辛普利鈉在大鼠近端小腸的吸收明顯高于遠(yuǎn)端，這與Pept1在大鼠小腸的分布密度從小腸近端至小腸遠(yuǎn)端逐漸降低的報(bào)道相一致［8－9］。隨著灌流液pH值的降低，藥物在大鼠各腸段的有效滲透系數(shù)均呈增大趨勢，且pH值越低增加越顯著，這可能是因?yàn)镻ept1是一種H＋同向協(xié)同的寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［10］，pH值的降低可為Pept1提供更多的 H＋，從而促進(jìn)了Pept1的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。Gly－Sar是Pept1的專屬性底物，本研究結(jié)果表明Gly－Sar對(duì)福辛普利鈉的吸收呈現(xiàn)隨濃度增加先促進(jìn)后抑制的趨勢。低濃度的二肽具有促進(jìn)福辛普利鈉的腸道吸收的作用，此現(xiàn)象可能與Gly－Sar促進(jìn)細(xì)胞頂膜的Pept1肽轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白表達(dá)，從而增加福辛普利鈉的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。在Shiraga等［11］進(jìn)行的研究中發(fā)現(xiàn)二肽可與Pept1基因啟動(dòng)子上的氨基酸敏感因子之間產(chǎn)生相互作用，提高Pept1 mRNA的轉(zhuǎn)錄活性，從而上調(diào)Pept1的蛋白表達(dá)。Walker等［12］在采用Gly－Sar處理Caco－2細(xì)胞24 h后，經(jīng) Western印跡法分析也發(fā)現(xiàn)Pept1的蛋白表達(dá)水平增加了近2倍。但當(dāng)二肽濃度進(jìn)一步增大時(shí)，二肽則可能與福辛普利鈉共同競爭Pept1轉(zhuǎn)運(yùn)體的轉(zhuǎn)運(yùn)位點(diǎn)，從而使底物藥物的吸收減少。雖然Gly－Sar對(duì)福辛普利鈉腸道吸收影響的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究進(jìn)行確證，但通過本文的研究可見影響Pept1活性的因素均可能會(huì)使福辛普利鈉的腸道吸收發(fā)生變化，福辛普利鈉在大鼠腸道的吸收易受到Pept1的表達(dá)豐度、腸腔pH值以及其他Pept1底物的影響。

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