周文佳， 王 蒙， 黃 明， 華雯妍， 張全英

(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院Ⅰ期臨床試驗(yàn)研究室，江蘇蘇州215004)

福辛普利是唯一含次磷酸基團(tuán)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，主要用于治療高血壓、心力衰竭等疾病，由于可經(jīng)肝、腎雙途徑清除，安全性好，故近年來其在臨床上的應(yīng)用及相關(guān)研究日益增多。福辛普利為酯類前藥，本身對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的抑制作用較弱，口服后在胃腸黏膜和肝臟迅速并完全水解為具有藥理活性的代謝產(chǎn)物福辛普利拉，后者通過其次磷酸基團(tuán)與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性部位中鋅離子結(jié)合，從而抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性［1］。雖然已有文獻(xiàn)報(bào)道福辛普利拉的血藥濃度測(cè)定方法，但其樣本處理大多采用液－液萃取法［2-3］或固相萃取法［4］，繁瑣耗時(shí)。本文則采用簡(jiǎn)便、快速、低耗的甲醇直接沉淀蛋白法處理血漿樣本，并建立LC-MS/ MS法測(cè)定福辛普利拉血藥濃度，考察福辛普利鈉片經(jīng)中國健康志愿者口服后的藥動(dòng)學(xué)特性。

1 材料

1.1 藥品與試劑

福辛普利鈉片(蒙諾?，規(guī)格:10 mg/片，中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào):1007090);福辛普利拉對(duì)照品(含量:99.8%，浙江華海藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):20100315);瑞巴派特(內(nèi)標(biāo)，含量: 99.9%，蘇州天馬醫(yī)藥集團(tuán)天吉生物制藥，批號(hào): 0180606003)。甲醇為色譜純，氨水和醋酸銨為分析純，水為去離子水。

1.2 儀器

API-4000型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB公司)，數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為Analyst 1.4.2;Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱:WATERS XTerra?RP18柱(150 mm×4.6 mm，5μm);柱溫:48℃;流動(dòng)相:6 mmoL·L－1醋酸銨水溶液(用氨水調(diào)節(jié)至 pH10.2)－甲醇(57∶43);流速:1.0 mL·min－1;進(jìn)樣量:40μL。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI);負(fù)離子電離模式;多反應(yīng)監(jiān)測(cè);撞氣壓力:8 psi(1 psi=6.895 kPa);氣簾氣壓力:25 psi;源內(nèi)氣體1壓力:70 psi，氣體2壓力: 60 psi;電噴霧電壓:－4 500 V;離子源溫度:750℃。檢測(cè)離子:福辛普利拉離子(m/z:434.2→236.9)，去簇電壓:－70 V，碰撞能量:－29 V;內(nèi)標(biāo)離子(m/z:369.0→169.9)，去簇電壓:－55 V，碰撞能量:－27 V。

2.3 血漿樣本處理及測(cè)定

精密吸取血漿樣本200μL至1.5 mL塑料離心管中，加入內(nèi)標(biāo)工作液(1.000 mg·L－1，用甲醇配制)50μL，渦旋混勻，加入甲醇500μL，渦旋1min，沉淀蛋白，于4℃、16 000 r·min－1離心10 min，精密吸取上清液100μL至進(jìn)樣瓶中，加入水相100μL，渦旋混勻，進(jìn)樣，進(jìn)行LC-MS/MS分析。

2.4 臨床試驗(yàn)方案

20名中國健康男性志愿者，體重(64.9±6.8)kg，身高(172.9±5.6)cm，年齡(24±2)歲，經(jīng)體檢合格后參加試驗(yàn)，并簽署知情同意書。本試驗(yàn)方案經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過。受試者在試驗(yàn)前2周及試驗(yàn)期間未服用其他任何藥物，試驗(yàn)期間統(tǒng)一飲食。受試者服藥前一天禁食過夜(約10 h)，試驗(yàn)開始當(dāng)天早晨空腹口服福辛普利鈉片10 mg，于服藥前和服藥后0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、15.0、24.0、36.0、48.0 h由肘靜脈取血樣3 mL置肝素化離心試管中，混勻，4 000 r·min－1離心5 min，分離所得血漿于－30℃冷凍保存待測(cè)。采用DAS2.0軟件處理血藥濃度－時(shí)間數(shù)據(jù)，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)評(píng)價(jià)

3.1.1 專屬性 分別吸取空白血漿、加入福辛普利拉對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)的空白血漿以及加入內(nèi)標(biāo)的受試者服藥后血漿樣本，按“2.3”項(xiàng)下方法處理并進(jìn)樣，記錄色譜圖(見圖1)。

圖1 LC-MS/MS專屬性試驗(yàn)色譜圖Figure 1 Chromatograms of LC-MS/MS specificity test

由圖1可見，福辛普利拉和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別約為3.5和2.6 min，且峰形良好，血漿樣本測(cè)定無雜質(zhì)干擾。

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低定量限 精密吸取20μL不同質(zhì)量濃度的福辛普利拉標(biāo)準(zhǔn)溶液(以甲醇為溶劑，用福辛普利拉對(duì)照品配制)至1.5 mL塑料離心管中，以氮?dú)獯蹈?，精密加?00μL空白血漿，渦旋混勻，配制成福辛普利拉質(zhì)量濃度分別為0.500 5、1.502、5.005、15.02、50.05、150.2、300.3μg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，按“2.3”項(xiàng)下方法處理并進(jìn)樣，記錄色譜圖。以福辛普利拉峰面積(As)和內(nèi)標(biāo)峰面積(Ai)的比值f(As/Ai)對(duì)福辛普利拉血藥濃度(C)進(jìn)行權(quán)重回歸，得回歸方程:f= 0.006 17×C+0.000 389，r=999 9，權(quán)重系數(shù)為1/C2。結(jié)果表明，福辛普利拉血藥濃度在0.500 5～300.3μg·L－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為0.5μg·L－1(RSD=5.3%，n=6)。

3.1.3 精密度和準(zhǔn)確度 按“3.1.2”項(xiàng)下方法制備福辛普利拉質(zhì)量濃度分別為 1.201、24.02、240.2μg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，每個(gè)濃度平行5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理并測(cè)定，每天1批，連續(xù)測(cè)定3批，同時(shí)制備隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線。用excel軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，計(jì)算批內(nèi)和批間精密度(RSD)以及準(zhǔn)確度［相對(duì)偏差(RE)］，結(jié)果顯示方法精密度和準(zhǔn)確度良好(見表1)。

表1 血漿中福辛普利拉檢測(cè)的精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果(±s，n=15)Table1 Result of precision and accuracy test for fosinoprilat in human plasma

表1 血漿中福辛普利拉檢測(cè)的精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果(±s，n=15)Table1 Result of precision and accuracy test for fosinoprilat in human plasma

加入量/ __μg·L－1測(cè)得量/ μg·L－1批內(nèi)RSD/ %批間RSD/ % RE/ % 1.201 1.188±0.041 3.6 2.2 －1.1 24.02 23.47±0.67 1.6 6.4 －2.3 __240.2_____224.7±12.5______________________________ 2.713.2_－6.5

3.1.4 提取回收率 按“3.1.2”項(xiàng)下方法制備福辛普利拉質(zhì)量濃度分別為1.201、24.02、240.2 μg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，并按“2.3”項(xiàng)下方法處理;另取空白血漿200μL至1.5 mL塑料離心管中，共3份，均加入甲醇500μL，渦旋1 min，于4℃、16 000 r·min－1離心10 min，取盡上清液，并在上清液中加入福辛普利拉對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)，使溶解，渦旋混勻，分別制得同上3個(gè)質(zhì)量濃度的福辛普利拉+內(nèi)標(biāo)溶液，精密吸取100μL至進(jìn)樣瓶中，加入100μL水相，混勻。以上兩種方法制得并處理的樣液每個(gè)濃度平行6份，分別進(jìn)樣測(cè)定，以兩種方法所獲同濃度樣液的峰面積比值計(jì)算提取回收率。結(jié)果測(cè)得，血漿中低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的福辛普利拉的提取回收率分別為(96.0± 5.7)%、(89.3±2.6)%和(89.4±2.3)%，內(nèi)標(biāo)的提取回收率為(92.3±3.0)%。

3.1.5 基質(zhì)效應(yīng) 精密吸取6個(gè)不同來源的空白血漿各200μL分別至1.5 mL塑料離心管中，均加入甲醇500μL，渦旋1 min，于4℃、16 000 r·min－1離心10 min，取上清液600μL作為血漿基質(zhì);另取去離子水200μL至1.5 mL塑料離心管中，同法處理得對(duì)照基質(zhì)。分別取血漿基質(zhì)和對(duì)照基質(zhì)，均加入福辛普利拉對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)，使溶解，渦旋混勻，制得同上3個(gè)質(zhì)量濃度的福辛普利拉+內(nèi)標(biāo)樣液，精密吸取100μL至進(jìn)樣瓶中，加入100μL水相，混勻。以上兩種樣液每個(gè)濃度平行6份，分別進(jìn)樣測(cè)定，以同濃度的兩種樣液的峰面積比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果測(cè)得，血漿中低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的福辛普利拉的基質(zhì)效應(yīng)分別為(93.0± 5.0)%、(93.1±9.7)%和(94.0±8.7)%，內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)為(93.7±5.2)%。

3.1.6 穩(wěn)定性 按“3.1.2”項(xiàng)下方法制備福辛普利拉質(zhì)量濃度分別為1.201、24.02、240.2μg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，分別于室溫放置4 h、－30℃反復(fù)凍融3次及－30℃保存至19 d，再按“2.3”項(xiàng)下方法處理并進(jìn)樣測(cè)定，或?qū)⑻幚砗蟮暮幯獫{樣本(即上清液)在自動(dòng)進(jìn)樣器于8℃放置15 h或福辛普利拉標(biāo)準(zhǔn)溶液于－40℃冷凍15 d后再進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果測(cè)得經(jīng)以上不同處置的各樣本中福辛普利拉含量均無明顯變化，表明福辛普利拉的甲醇溶液及血漿樣本穩(wěn)定性良好。

3.2 藥動(dòng)學(xué)評(píng)價(jià)

按“2.4”項(xiàng)下方案，20名健康受試者口服福辛普利鈉片后，在各時(shí)間點(diǎn)采集血樣，分離血漿，再按“2.3”項(xiàng)下方法處理并進(jìn)樣，測(cè)得福辛普利拉血藥濃度，繪制平均血藥濃度－時(shí)間曲線(見圖2);且發(fā)現(xiàn)福辛普利拉在體內(nèi)的經(jīng)時(shí)過程符合二房室模型，其主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道［3，5］基本一致:Cmax為(148.4±43.9)μg·L－1，Tmax為(4.05±0.76)h，AUC0-48h為(1 315±342)μg·h·L－1，AUC0-∞為(1 335±341)μg·h·L－1，CL/F(清除率)為(7.957± 1.969)L·h－1，Vd(表觀分布容積)為(103.9± 41.2)L，t1/2為(8.94±2.62)h。

圖2 福辛普利拉的平均血藥濃度－時(shí)間曲線(±s，n=20)Figure 2 Mean plasma concentration-time curves of fosinoprilat

4 討論

福辛普利拉結(jié)構(gòu)中含有次磷酸基、氨基和羧基，因此流動(dòng)相的pH值對(duì)其色譜行為至關(guān)重要。色譜試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水相pH小于7時(shí)，福辛普利拉吸附在色譜系統(tǒng)中，甚至無法洗脫;當(dāng)水相pH大于7而小于10時(shí)，福辛普利拉峰形差，靈敏度低，重現(xiàn)性差;而當(dāng)水相pH大于10時(shí)，福辛普利拉可獲得較好的色譜峰形，并可使次磷酸基和羧基充分解離，避免氨基帶正電荷，有利于負(fù)離子的生成，提高響應(yīng)。但采用pH大于10的純水相系統(tǒng)時(shí)，福辛普利拉在色譜柱上幾乎無保留，因此需向水相中添加醋酸銨，以增加其在色譜柱上的保留，從而有利于其與血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)分離，減小基質(zhì)效應(yīng)，同時(shí)醋酸銨可與氨水形成緩沖鹽，保持色譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性。由于只有在極端的堿性條件下才能避免ESI離子源的不銹鋼表面對(duì)磷酸鹽化合物的吸附［6］，因此本文選用了WATERSXTerra?RP18色譜柱，從而保證色譜系統(tǒng)在pH1～12范圍內(nèi)的穩(wěn)定性和耐用性，且該色譜柱具有內(nèi)嵌極性基團(tuán)的固定相，分析時(shí)可在固定相的表面形成水層，而水屏蔽層能夠掩蔽解離后帶負(fù)電的硅羥基，可有效阻止含氮化合物與硅膠表面殘留硅羥基間的作用，減少拖尾現(xiàn)象發(fā)生［7］。

基質(zhì)是指生物樣本中除待分析物以外的一切組成，包括蛋白、磷脂及其他內(nèi)源性物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)中，由于對(duì)血漿樣本的處理采用了蛋白直接沉淀法，因此在基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)中，不同于一般液－液提取法所采用的流動(dòng)相溶解對(duì)照品或提取揮干的血漿樣本殘?jiān)姆椒?，而是將去離子水和空白血漿以相同的處理方法制備對(duì)照基質(zhì)和血漿基質(zhì)，然后分別加入福辛普利拉對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)，再以水相配成近似于流動(dòng)相的溶樣環(huán)境后進(jìn)樣分析。這是因?yàn)椋绻苯佑昧鲃?dòng)相溶解對(duì)照樣本，則與擬定的樣本處理后的進(jìn)樣條件有所不同，而樣本所處的溶樣環(huán)境不同可能引起響應(yīng)的差異，進(jìn)而導(dǎo)致測(cè)定誤差。本文基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)的最后一步“精密吸取100μL該溶液至進(jìn)樣瓶中，加入100μL水相，混勻，進(jìn)樣”即是為了保證同時(shí)將血漿基質(zhì)樣本和對(duì)照樣本配成近似于流動(dòng)相的溶樣環(huán)境，而又與擬定的樣本處理方法相同。

本文建立的分析方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏，適用于福辛普利鈉片的臨床藥動(dòng)學(xué)研究。

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