王魯北，張春紅，王小敏，吳文龍，李維林

〔江蘇省·中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)，江蘇 南京 210014〕

黑莓(Rubus spp.)隸屬于薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(Rubus L.)，為半灌木漿果類果樹，其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，具有防衰老和提高人體免疫力等功效［1－2］，是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外新興起的第三代果樹之一，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因而，開展優(yōu)良黑莓品種的培育和推廣具有重要的應(yīng)用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前，黑莓育種多以實(shí)生選優(yōu)、雜交育種、輻射育種等手段為主［3］，但是這些方法具有一定的局限性，進(jìn)程也比較慢，嚴(yán)重制約了黑莓優(yōu)良品種的選育。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，基因工程技術(shù)為黑莓育種開辟了一條新途徑，通過(guò)基因工程方法，可以有針對(duì)性地引入特定基因，從而獲得具有優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因黑莓植株。

‘Arapaho’是由美國(guó)阿肯色州大學(xué)于1992年推出的一個(gè)黑莓品種［4］。該品種于2004年被引入南京，表現(xiàn)出直立、無(wú)刺、早熟的優(yōu)良特性，但適應(yīng)性較差［5］。因此，可利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入相關(guān)抗逆基因，以提高‘Arapaho’的抗逆性，使其更適宜在南京地區(qū)種植。

目前常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法為葉盤法，其成功的關(guān)鍵在于擁有一個(gè)高效而穩(wěn)定的不定芽離體再生系統(tǒng)，因此，離體葉片再生體系的建立是開展果樹生物技術(shù)育種的重要基礎(chǔ)。然而，目前有關(guān)黑莓組織培養(yǎng)的研究均以莖尖和腋芽培養(yǎng)為主，關(guān)于葉片再生培養(yǎng)的研究報(bào)道較少［6－9］，而有關(guān)黑莓品種‘Arapaho’離體葉片再生體系的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

鑒于此，作者以黑莓品種‘Arapaho’葉片為外植體，對(duì)影響葉片不定芽植株再生的培養(yǎng)條件(包括基本培養(yǎng)基類型、6－BA和IBA質(zhì)量濃度、暗培養(yǎng)時(shí)間及外植體的葉位和接種方式)以及不定芽生根的適宜IBA質(zhì)量濃度進(jìn)行比較研究，篩選出適合黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽植株再生的培養(yǎng)體系，以期為其品質(zhì)改良和遺傳轉(zhuǎn)化奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料及基本培養(yǎng)條件

黑莓品種‘Arapaho’無(wú)菌苗葉片取自江蘇省·中國(guó)科學(xué)院植物研究所黑莓組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室。該無(wú)菌苗誘導(dǎo)自大田植株當(dāng)年生新梢上帶腋芽的莖段，并在含0.5 mg·L－16－BA和0.3 mg·L－1NAA的MS培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)30～40 d。取無(wú)菌苗中上部完全展開的葉片，剪去葉尖及葉緣并保留2～3 mm葉柄，作為外植體。

除特殊說(shuō)明外，均取無(wú)菌苗形態(tài)學(xué)第1位至第5位的葉片，葉面朝上接種在培養(yǎng)基上，接種后均先暗培養(yǎng)3周后再進(jìn)行光照培養(yǎng)。參照文獻(xiàn)［10］設(shè)置培養(yǎng)基的pH和瓊脂濃度及基本培養(yǎng)條件(如光照強(qiáng)度、培養(yǎng)溫度和時(shí)間等)。

1.2 方法

1.2.1 基本培養(yǎng)基類型和外源激素質(zhì)量濃度的比較 采用4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法〔L9(3)4〕，4個(gè)因素包括基本培養(yǎng)基類型(MS、WPM和N6)、6－BA質(zhì)量濃度(1.0、2.0和4.0 mg·L－1)、IBA質(zhì)量濃度(0.1、0.5和1.0 mg·L－1)和空列，培養(yǎng)40 d后觀察并統(tǒng)計(jì)葉片不定芽誘導(dǎo)率及平均不定芽數(shù)。每處理4瓶，每瓶接種5片葉，并重復(fù)3次。

1.2.2 暗培養(yǎng)時(shí)間的比較 將外植體葉片接種于含有2.0 mg·L－16－BA和1.0 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基上，分別經(jīng)過(guò)0(CK)、7、14、21和28 d的暗培養(yǎng)后再進(jìn)行光照培養(yǎng)，40 d后統(tǒng)計(jì)葉片不定芽誘導(dǎo)率及平均不定芽數(shù)。每處理接種4瓶，每瓶接種5片葉，并重復(fù)3次。

1.2.3 葉位的比較 分別取無(wú)菌苗形態(tài)學(xué)的1和2位、3和4位、5和6位、7和8位、9和10位葉片，接種于含有2.0 mg·L－16－BA和1.0 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計(jì)葉片不定芽誘導(dǎo)率及平均不定芽數(shù)。每處理4瓶，每瓶接種5片葉，并重復(fù)3次。

1.2.4 接種方式的比較 按照葉面朝上和葉面朝下2種方式將葉片接種于含有2.0 mg·L－16－BA和1.0 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計(jì)葉片不定芽誘導(dǎo)率及平均不定芽數(shù)。每處理4瓶，每瓶接種5片葉，并重復(fù)3次。

1.2.5 生根培養(yǎng)基中IBA添加量的比較 誘導(dǎo)培養(yǎng)30 d后將不定芽從外植體上切下，接種于含有0.5 mg·L－16－BA和0.3 mg·L－1NAA的MS培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，不定芽高約2 cm時(shí)，將其從基部切下，分別接種于含有0.05、0.10、0.20和0.50 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根；20 d后測(cè)量和統(tǒng)計(jì)不定芽的生根率及單株的平均根干質(zhì)量、根數(shù)和根長(zhǎng)。每處理3瓶，每瓶3～4個(gè)不定芽，并重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

參照以下公式分別計(jì)算不定芽誘導(dǎo)率、平均不定芽數(shù)、生根率和平均根數(shù)：不定芽誘導(dǎo)率=(形成不定芽的葉片數(shù)/接種的葉片總數(shù))×100％；平均不定芽數(shù)=不定芽總數(shù)/形成不定芽的葉片數(shù)；生根率=(生根的不定芽數(shù)/接種的不定芽總數(shù))×100％；平均根數(shù)=根總數(shù)/生根不定芽總數(shù)。

采用Excel 2007軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和差異顯著性分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 葉片不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中影響因素的分析

2.1.1 基本培養(yǎng)基類型和外源激素質(zhì)量濃度的比較 接種2周左右，葉片邊緣貼近培養(yǎng)基的地方開始出現(xiàn)少量綠色或黃綠色愈傷組織；培養(yǎng)20 d后，在葉片部分傷口及愈傷組織處可以看到明顯的綠色芽點(diǎn)，尤以葉片和葉柄相連接處傷口的芽點(diǎn)數(shù)居多；隨后，芽點(diǎn)迅速生長(zhǎng)，發(fā)育為不定芽。

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1)表明：在基本培養(yǎng)基類型和外源激素質(zhì)量濃度不同的培養(yǎng)基中葉片的不定芽誘導(dǎo)率存在差異，在9個(gè)處理組中，含有2.0 mg·L－16－BA和0.5 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基的不定芽誘導(dǎo)效果最佳，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)64.52％，平均不定芽數(shù)為3.85。3個(gè)因素按不定芽誘導(dǎo)率由大到小依次排序?yàn)榛九囵B(yǎng)基類型、6－BA質(zhì)量濃度、IBA質(zhì)量濃度，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基應(yīng)為含有2.0 mg·L－16－BA和1.0 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基；3個(gè)因素按平均不定芽數(shù)由大到小依次排序?yàn)榛九囵B(yǎng)基類型、IBA質(zhì)量濃度、6－BA質(zhì)量濃度，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基應(yīng)為含有2.0 mg·L－16－BA和0.5 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基。對(duì)于離體葉片再生體系而言，葉片不定芽誘導(dǎo)率是首要的考察指標(biāo)，因而，含有2.0 mg·L－16－BA和1.0 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基為黑莓品種‘Arapaho’離體葉片不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基。

表1 黑莓品種‘Arapaho’離體葉片不定芽誘導(dǎo)體系中基本培養(yǎng)基類型和外源激素質(zhì)量濃度的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果1)Table 1 Orthogonal experiment result of basic medium type and exogenous hormone concentration in induction system of adventitious bud from in vitro leaves of blackberry cultivar‘Arapaho’1)

2.1.2 暗培養(yǎng)時(shí)間的比較 暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽誘導(dǎo)的影響見(jiàn)表2。結(jié)果表明：與對(duì)照相比，經(jīng)過(guò)不同時(shí)間的暗培養(yǎng)，不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)有一定差異；經(jīng)過(guò)21 d的暗培養(yǎng)，不定芽誘導(dǎo)率極顯著高于對(duì)照(P＜0.01)，但平均不定芽數(shù)與對(duì)照差異不顯著。隨暗培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)均呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，其中暗培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到21 d，不定芽誘導(dǎo)率最高(67.08％)；但暗培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至28 d，葉片不定芽誘導(dǎo)率下降至51.63％。說(shuō)明暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽形成有重要影響，適宜的暗培養(yǎng)時(shí)間可提高葉片的不定芽誘導(dǎo)率，但暗培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)導(dǎo)致不定芽誘導(dǎo)率降低。綜合分析結(jié)果顯示：在黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中，最適宜的暗培養(yǎng)時(shí)間為21 d。

表2 暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)的影響1)Table 2 Effects of dark culture time on induction rate and average number of adventitious bud from in vitro leaves of blackberry cultivar‘Arapaho’1)

2.1.3 外植體葉位的比較 外植體葉位對(duì)黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽誘導(dǎo)的影響見(jiàn)表3。結(jié)果表明：采用不同葉位的葉片作為外植體，不定芽誘導(dǎo)率存在一定差異，其中，第3至第6位葉的不定芽誘導(dǎo)率極顯著高于第9和第10位葉，但平均不定芽數(shù)差異不顯著。第3和第4位葉的不定芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)到71.74％，平均不定芽數(shù)也最多，為2.46；第5和第6位葉的不定芽誘導(dǎo)率為66.47％，平均不定芽數(shù)為2.31。綜合分析結(jié)果顯示：黑莓品種‘Arapaho’植株中、上部葉片的不定芽誘導(dǎo)能力優(yōu)于下部葉片，其中第3和第4葉位為適宜的外植體取樣葉位。

表3 外植體葉位對(duì)黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)的影響1)Table 3 Effects of leaf position of exp lants on induction rate and average number of adventitious bud from in vitro leaves of blackberry cultivar‘Arapaho’1)

2.1.4 接種方式的比較 采用葉片正放和反放2種方式進(jìn)行接種，黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)有明顯差異。采用正放方式(即葉面朝上)接種的葉片不定芽誘導(dǎo)率達(dá)64.29％，平均不定芽數(shù)為2.87；采用反放方式(即葉面朝下)接種的葉片不定芽誘導(dǎo)率為32.87％，平均不定芽數(shù)為1.44。差異顯著性分析結(jié)果表明：2種接種方式的葉片不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)差異極顯著(P＜0.01)。綜合分析結(jié)果表明：在黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中，適宜的外植體接種方式是葉片正放。

2.2 IBA質(zhì)量濃度對(duì)不定芽生根的影響

觀察結(jié)果表明：接種在生根培養(yǎng)基上10 d后，黑莓品種‘Arapaho’的不定芽開始萌根，隨后根開始進(jìn)行伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，20 d后形成完整植株。表4結(jié)果表明：接種在含有0.00～0.50 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基上，不定芽的生根率均達(dá)到100.0％；但部分培養(yǎng)基的平均生根數(shù)、平均根長(zhǎng)和平均單株根干質(zhì)量存在顯著或極顯著差異。在不添加IBA的MS培養(yǎng)基(對(duì)照)上，不定芽的平均根長(zhǎng)最長(zhǎng)(4.4 cm)，但平均根數(shù)少，根細(xì)長(zhǎng)且側(cè)根很少；在添加0.20 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基上，平均根長(zhǎng)較長(zhǎng)(3.20 cm)，平均根數(shù)最多(6.90條)，平均單株根干質(zhì)量最大(8.10 mg)，且平均根數(shù)和平均單株根干質(zhì)量極顯著高于對(duì)照(P＜0.01)。綜合分析結(jié)果顯示：含有0.2 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基是最適宜于黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽生根的培養(yǎng)基，生根率可達(dá)100.0％，且側(cè)根較多、根長(zhǎng)勢(shì)良好。

表4 生根培養(yǎng)基中IBA質(zhì)量濃度對(duì)黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽生根的影響1)Table 4 Effect of IBA concentration in rootingmedium on rooting of adventitious bud from in vitro leaves of blackberry cultivar‘Arapaho’1)

3 討論和結(jié)論

通常，外源激素種類和濃度以及基本培養(yǎng)基類型是影響植株再生的關(guān)鍵因素。不同基因型黑莓離體葉片的再生能力迥異，其適宜的外源激素的種類、濃度和配比等條件差異較大。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：基本培養(yǎng)基類型對(duì)黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽誘導(dǎo)的影響最大，在供試的3種基本培養(yǎng)基(MS、WPM和N6)中，MS培養(yǎng)基最適于黑莓‘Arapaho’葉片不定芽誘導(dǎo)；而基本培養(yǎng)基中需要添加的最佳激素組合為2.0 mg·L－16－BA和1.0 mg·L－1IBA，這與他人的相關(guān)研究結(jié)果有一定差異。由文獻(xiàn)［9，11］可見(jiàn)：MS是適合黑莓葉片再生的基本培養(yǎng)基，但培養(yǎng)基中添加的外源激素以TDZ居多。其原因可能與不同基因型黑莓的內(nèi)源激素水平和生理狀態(tài)等相關(guān)。由于作者僅研究了6－BA和IBA組合對(duì)黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽誘導(dǎo)的影響，而TDZ是否可以使其不定芽誘導(dǎo)率達(dá)到更高，則有待進(jìn)一步研究。

目前，在許多植物的離體葉片培養(yǎng)中均證實(shí)暗培養(yǎng)可以促進(jìn)不定芽的誘導(dǎo)［12－14］，本研究也得出了類似的結(jié)果。雖然暗培養(yǎng)不是黑莓品種‘Arapaho’離體葉片不定芽誘導(dǎo)的必需條件，但可顯著提高不定芽誘導(dǎo)率，而對(duì)不定芽數(shù)的影響卻不明顯。

以黑莓品種‘Arapaho’第3和第4位葉為外植體，不定芽誘導(dǎo)率最高；其次是第5和第6位葉；第1和第2位葉的不定芽誘導(dǎo)率也較高；而第7至第10位葉的不定芽誘導(dǎo)率最低，均在40％以下。說(shuō)明黑莓品種‘Arapaho’無(wú)菌苗植株的中、上部葉片比下部葉片的再生能力強(qiáng)，有利于不定芽分化，這與周瑞金等［15］的研究結(jié)果相似，其原因可能與不同葉位葉片的內(nèi)源激素水平分布差異有關(guān)。

離體葉片的接種方式對(duì)葉片再生效應(yīng)的影響有差異。在黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中，正放(葉面朝上)葉片的不定芽誘導(dǎo)率及平均不定芽數(shù)均極顯著高于反放(葉面朝下)葉片。可見(jiàn)，葉面朝上接種更有利于黑莓品種‘Arapaho’不定芽的誘導(dǎo)，這與Nehra等［16］和安偉［17］的研究結(jié)果有一定差異，其原因可能與黑莓葉片背面氣孔多、結(jié)構(gòu)疏松，更有利于營(yíng)養(yǎng)的吸收有關(guān)。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步建立了適宜于黑莓品種‘Arapaho’離體葉片的再生體系：取無(wú)菌苗第3和第4位葉片，適當(dāng)修剪后，葉面朝上接到含2.0 mg·L－16－BA和1.0 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)21 d后進(jìn)行光照培養(yǎng)；30 d后將不定芽接種到含有0.5mg·L－16－BA和0.3mg·L－1NAA的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)；待不定芽高約2 cm時(shí)接種到含有0.2 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。

［1］張勝利.樹莓和黑莓［J］.新疆林業(yè)，2002(5)：40.

［2］吳文龍，李維林，閭連飛，等.不同品種黑莓鮮果營(yíng)養(yǎng)成分的比較［J］.植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2007，16(1)：58－61.

［3］吳文龍，李維林，閭連飛，等.黑莓引種栽培與利用［M］.南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，2010：1－3.

［4］MOORE JN，Clark JR.‘Arapaho’erect，thornless blackberry［J］.HortScience，1993，28(8)：861－862.

［5］任冰如，吳文龍，閭連飛，等.不同黑莓品種的抗凍性分析［J］.植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2008，17(1)：54－56.

［6］李海燕，王小敏，李維林，等.黑莓品種‘Chester’離體培養(yǎng)過(guò)程中適宜激素種類和濃度以及光照度的篩選［J］.植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2010，19(2)：68－74.

［7］TURK B A，SWARTZH J，ZIMMERMAN R H.Adventitious shoot regeneration from in vitro：cultured leaves of Rubus genotypes［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1994，38(1)：11－17.

［8］MENG R G，CHEN T H H，F(xiàn)INN C E，et al.Improving in vitro plant regeneration from leaf and petiole explants of‘Marion’blackberry［J］.HortScience，2004，39(2)：316－320.

［9］吳延軍，謝 鳴，蔣桂華，等.黑莓試管苗葉片植株的再生［J］.果樹學(xué)報(bào)，2006，23(3)：468－470，F(xiàn)0004.

［10］王小敏，吳文龍，李海燕，等.黑莓外植體褐化影響因素分析及適宜培養(yǎng)條件篩選［J］.植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2009，18 (3)：63－68.

［11］GUPTA S，MAHALAXMIV.In vitro high frequency direct plant regeneration from whole leaves of blackberry［J］.Scientia Horticulturae，2009，120(1)：22－26.

［12］徐凌飛，馬鋒旺，王喆之，等.梨葉片離體培養(yǎng)和植株再生［J］.園藝學(xué)報(bào)，2002，29(4)：367－368.

［13］王 翡，高志紅，章 鎮(zhèn)，等.草莓高效離體葉片再生體系的建立［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2010，30(5)：1045－1049.

［14］師校欣，杜國(guó)強(qiáng)，高 儀，等.黑暗培養(yǎng)對(duì)蘋果組培快繁及葉片再生的影響［J］.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27(4)：18－21.

［15］周瑞金，劉孟軍.棗離體葉片高效再生植株的研究［J］.園藝學(xué)報(bào)，2006，33(3)：625－628.

［16］NEHRA N S，STUSHNOFF C，KARTHA K K.Direct shoot regeneration from strawberry leaf disks［J］.Journal of the American Society for Horticultural Science，1989，114(6)： 1014－1018.

［17］安 偉.樹莓葉片離體再生及植酸酶基因轉(zhuǎn)化的研究［D］.長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，2002：14.