高麗麗，余衛(wèi)平

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)系，江蘇南京 210009)

SET7/9含有SET結(jié)構(gòu)域，是蛋白賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶 (proteinlysinemethyltransferases，PLMTs或PKMTs)家族成員。有報(bào)道稱之為SET7，也有報(bào)道稱之為SET9［1-2］。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)SET7/9催化的非組蛋白甲基化作用能引起蛋白穩(wěn)定性改變和基因表達(dá)變化等多種分子效應(yīng)，涉及到染色體結(jié)構(gòu)、細(xì)胞周期及凋亡等方面。因研究需要，我們建立了活性GST-SET7/9融合蛋白(SET7/9融合蛋白)表達(dá)系統(tǒng)與純化方法。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體

本實(shí)驗(yàn)所需的大腸桿菌CM1061菌株、大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)菌株、pCMV-SET7/9質(zhì)粒均由本課題組保存;原核表達(dá)載體質(zhì)粒pGEX-6P-3由Amersham Biosciences公司提供。

1.2 主要試劑

PCR產(chǎn)物純化、質(zhì)粒提取試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品;PCR酶、限制性內(nèi)切酶購(gòu)自 TaKaRa公司;T4 DNA連接酶由New England Biolabs公司提供;Glutathione Agarose吸附柱為Sigma公司產(chǎn)品;人組蛋白H3由 upstate公司提供;Adenosel-L-Methionine，S-K［methyl-3H］由PerkinElmer公司提供;Bio-Rad蛋白測(cè)定試劑盒由BIO-RAD公司提供;引物合成、測(cè)序均在INVITROGEN公司完成。

1.3 pGEX-SET7/9原核重組表達(dá)載體的構(gòu)建

1.3.1 設(shè)計(jì)與合成寡聚核苷酸引物 目的基因?yàn)楹琒ET結(jié)構(gòu)區(qū)的SET7/9基因片段，位于pCMV-SET7/9全基因序列的第268～1 365個(gè)核苷酸。通過NCBI GenBank確定pCMV-SET7/9的cDNA序列，選擇EcoRⅠ和XhoⅠ作為酶切位點(diǎn)，采用DNA Star軟件設(shè)計(jì)SET7/9引物。SET7/9引物上游:5'-ACCGAATTCCAT GGATAGCGACGAC-3'，含EcoRⅠ酶切位點(diǎn)及啟始密碼子;SET7/9引物下游:5'-CTCCTCGAGTCATTACTTT TGCTGGGTGGCCTG-3'，含終止密碼子及XhoⅠ酶切位點(diǎn)。

1.3.2 擴(kuò)增目的基因 以pCMV-SET7/9質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增目的基因。等量去離子水代替模板作為陰性對(duì)照。其反應(yīng)條件為94℃ 13 min熱啟動(dòng);94℃1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，純化回收，產(chǎn)物純化后測(cè)序確認(rèn)。

1.3.3 構(gòu)建pGEX-SET7/9表達(dá)載體 將原核表達(dá)載體pGEX-6P-3轉(zhuǎn)入大腸桿菌CM1061菌株。挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)，大量提取質(zhì)粒DNA。將純化后的PCR產(chǎn)物和pGEX-6P-3質(zhì)粒分別用核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ與XhoⅠ進(jìn)行酶切，電泳鑒定并用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，氯仿抽提法回收。用T4 DNA連接酶連接含SET7/9的基因片段與表達(dá)載體，獲得pGEX-SET7/9重組質(zhì)粒。

接種轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)單菌落至10 ml含氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日按1∶100的比例轉(zhuǎn)接過夜培養(yǎng)菌至15 ml含氨芐青霉素液體培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.6左右，均分該培養(yǎng)物為兩部分:一部分加入異丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1 mmol·L-1以誘導(dǎo)SET7/9融合蛋白表達(dá)，在誘導(dǎo)培養(yǎng)的不同時(shí)間(0、1、2、3、4 h)收取菌液，各取1 ml培養(yǎng)物離心后留沉淀置-70℃保存待用;另一部分不加IPTG，相同方法收取不同時(shí)間段的細(xì)菌沉淀作對(duì)照。將收集到的細(xì)菌菌體用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS PAGE)法，檢測(cè)與鑒定含pGEXSET7/9質(zhì)粒的陽(yáng)性菌落。

1.4 SET7/9融合蛋白的表達(dá)與提純

挑取單一陽(yáng)性菌落接種在10 ml含青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日按1∶100的比例轉(zhuǎn)接于500 ml含青霉素抗性的培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.6左右，加入IPTG至終濃度為1 mmol·L-1以誘導(dǎo)GST-SET7/9表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)5.0 h。離心收取菌體用5 ml PBS重新懸浮細(xì)胞于4℃超聲破碎以裂解細(xì)菌，利用Glutathione Agarose吸附柱提純SET7/9融合蛋白，產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，確定目的蛋白所在部位。

1.5 SET7/9融合蛋白的組蛋白甲基化作用分析

采用Bio-Rad蛋白測(cè)定試劑盒檢測(cè)純化的SET7/9融合蛋白濃度，組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶(HMT)測(cè)定法分析蛋白活性。通過LS6000IC型液閃儀(BECKMAN公司)測(cè)得的每分鐘脈沖數(shù)(CPM)反映蛋白質(zhì)HMT活性。

2 結(jié) 果

2.1 pGEX-SET7/9重組質(zhì)粒的PCR鑒定

pGEX-SET7/9重組質(zhì)粒通過PCR擴(kuò)增，其目的基因長(zhǎng)度為1 123 bp，與分子質(zhì)量參照物(DNA Ladder)相比，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小與預(yù)測(cè)結(jié)果一致(圖1)。

圖1 PCR擴(kuò)增SET7/9結(jié)果(1%瓊脂糖凝膠電泳)Fig 1 Amplification of SET7/9 with PCR(1%agarose gel)

2.2 SET7/9融合蛋白的表達(dá)與純化

SET7/9融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色發(fā)現(xiàn)，含重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)菌在分子質(zhì)量大約77 kD位置出現(xiàn)一蛋白條帶。已知目的基因表達(dá)的多肽分子質(zhì)量為50 kD，與融合蛋白共同表達(dá)分子質(zhì)量約為77 kD，故獲得的純化蛋白分子質(zhì)量與理論估計(jì)值相一致(圖2)。

圖2 提純SET7/9融合蛋白的SDS-PAGE結(jié)果Fig 2 SDS-PAGE showing the purification of SET7/9 protein

2.3 SET7/9融合蛋白的組蛋白甲基化作用

采用HMT測(cè)定法可見，孵育30、60、120 min后的樣本，純化SET7/9融合蛋白組CPM值均明顯高于對(duì)照組(GST蛋白質(zhì)組)，與對(duì)照組相比分別增加21.7%、19.8%、22.1%，且與作用時(shí)間呈正相關(guān)，表明融合蛋白SET部分具有HMT活性(表1)。

表1 純化SET7/9蛋白的組蛋白甲基化作用分析Tab 1 Histone methylation analysis of the purified SET7/9 protein

3 討 論

SET7/9蛋白分子質(zhì)量大約為50 kD，其表達(dá)基因位于第4號(hào)染色體4q28。SET7/9所含的SET結(jié)構(gòu)域具有由β折疊環(huán)繞成的類似繩結(jié)的三級(jí)結(jié)構(gòu)［3-5］。最初發(fā)現(xiàn)SET7/9是靶向組蛋白H3第4位賴氨酸(H3K4)的甲基化轉(zhuǎn)移酶，但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SET7/9只對(duì)游離的H3K4而非核小體H3K4有高度活性［1-2，4］。此外，SET7/9 還能使膜相關(guān)受體、轉(zhuǎn)錄因子、腫瘤抑制因子等蛋白賴氨酸甲基化，從而調(diào)節(jié)這些非組蛋白的功能［6-7］。

SET7/9對(duì)非組蛋白賴氨酸的甲基化作用會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)，如甲基化p53的K372位點(diǎn)可增加p53穩(wěn)定性及其對(duì)靶基因的活化作用;甲基化衍生因子(elongation factor，E2F1)的K185位點(diǎn)可抑制該蛋白的乙酰化和磷酸化，并激活蛋白泛素化，抑制凋亡;還可使成視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，pRb)、雌激素受體 α (estrogen receptor α，ERα)等蛋白甲基化，影響它們的生物學(xué)效應(yīng)［6-7］?？梢奡ET7/9催化的非組蛋白賴氨酸甲基化作用可能與腫瘤等疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)［6-7］。

為了開展SET7/9對(duì)非組蛋白甲基化修飾及其效應(yīng)的研究，我們需要?jiǎng)?chuàng)建SET7/9蛋白表達(dá)系統(tǒng)。本項(xiàng)工作所構(gòu)建的pGEX-SET7/9重組質(zhì)粒在原核細(xì)胞中能夠表達(dá)SET7/9融合蛋白。純化的SET7/9融合蛋白通過HMT活性測(cè)定有明顯的組蛋白甲基化作用，表明pGEX-SET7/9能夠表達(dá)高活性的SET7/9融合蛋白［8］。這會(huì)為我們后續(xù)相關(guān)工作提供幫助。

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