姚紅，朱曉蘇，徐康萍，周海俠，趙昀

(1.蘇州大學(xué)唐仲英血液學(xué)研究中心，江蘇蘇州 215123;2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，江蘇蘇州 215006)

人類慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是源自造血干細(xì)胞的惡性血液腫瘤。格列衛(wèi)能緩解慢性期CML患者的癥狀，但單一藥物尚不能治愈。尋找新的靶點(diǎn)、設(shè)計(jì)新藥物已成為CML研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)［1］。哺乳動物Rho家族屬于小GTP結(jié)合蛋白，包括22個(gè)成員［2］。其中RhoA，Rac1和Cdc42已被廣泛研究。大量研究發(fā)現(xiàn)Rho蛋白調(diào)控癌細(xì)胞的增殖、存活、浸潤與血管新生［3］。例如，RhoA、RhoC 以及Rac1、Cdc42 促進(jìn)腫瘤形成、癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［4］。RhoB是Rho家族中較為特殊的一員，在實(shí)體腫瘤中則作為抑制子或負(fù)性調(diào)控子。脂類修飾是調(diào)控RhoB功能的重要方式之一，RhoB蛋白能進(jìn)行法尼基(F)和牻牛兒基牻牛兒基(GG)兩種修飾，這與多數(shù)其它Rho蛋白僅能進(jìn)行一種類型的脂類修飾不同［5］。這些研究為實(shí)體腫瘤的治療提供了新思路。但是，目前RhoB在人CML中的作用及其機(jī)制尚不明確。本研究使用慢病毒在人CML細(xì)胞中過表達(dá)RhoB，研究其對CML細(xì)胞增殖能力的影響;使用幾種與RhoB脂類修飾相關(guān)的突變體研究RhoB是否需要脂類修飾行使其生物學(xué)功能及何種類型的脂類修飾是RhoB生物學(xué)功能所必需的;探討RhoB及各種脂類修飾變體對CML細(xì)胞周期進(jìn)程的影響，初步揭示RhoB對調(diào)控CML細(xì)胞生長的作用機(jī)制，為CML的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人成巨核細(xì)胞白血病MEG-01細(xì)胞系(BCR-ABL陽性)購于上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。CML患者骨髓樣本來源于蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院。

1.1.2 主要試劑 Ex Taq DNA聚合酶、PMD19-T載體、T4DNA連接酶、EcoRⅠ、XhoⅠ、BglⅡ限制性內(nèi)切酶均購于TaKaRa公司，碘化丙啶、RNase A和鼠抗人單克隆Actin抗體購于Sigma公司。PCR引物合成及基因序列檢測均由上海生物工程公司完成。兔抗人RhoB多克隆抗體購于Santa Cruz Biotechnology公司。CD34細(xì)胞純化試劑盒、纖粘連蛋白、甲基纖維素均購于StemCell Technologies公司。

1.1.3 主要儀器 流式細(xì)胞分析及分選儀(美國BD，Beckman Coulter)，紫外凝膠成像儀(美國 Bio-Rad)，垂直電泳儀和轉(zhuǎn)印電泳儀(上海天能)，PCR儀(德國Biometra)，倒置顯微鏡(日本Olympus)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RhoB基因及其3個(gè)脂類修飾變體的克隆 參考NCBI網(wǎng)站公布的RhoB cDNA序列，設(shè)計(jì)如表1所示PCR引物［5］。PCR擴(kuò)增出目的片段后使用T4DNA連接酶與PMD19-T載體連接，用BglⅡ?qū)y序正確的目的基因切割純化，再與線性化的Venus載體連接。用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切鑒定連接正反向。

表1 RhoB基因及其3個(gè)脂類修飾變體PCR引物設(shè)計(jì)Tab 1 List of primer sequences

1.2.2 慢病毒的制備 將慢病毒表達(dá)載體通過磷酸鈣沉淀的方式將其與其他3種包裝質(zhì)粒△R，VSV-G和Rev共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染后48和72 h的培養(yǎng)上清，0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩⒉《旧锨暹M(jìn)行1次超離心濃縮，獲得超過100倍的濃縮病毒。

1.2.3 CML患者CD34+細(xì)胞的純化與病毒侵染 將CML患者骨髓樣本經(jīng)密度梯度離心分離出骨髓單核細(xì)胞，利用免疫磁珠正向富集的方法純化出CD34+細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)2 d后進(jìn)行病毒侵染。先將濃縮病毒加到包被有纖粘連蛋白的96孔板中，4℃放置1～2 h后加入細(xì)胞，37℃共孵育12 h，PBS洗滌細(xì)胞3次后繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后進(jìn)行流式分選，YFP+細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 細(xì)胞增殖和集落生成實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):在24孔板中每孔種植5×104個(gè)YFP+細(xì)胞，培養(yǎng)的第3天和第6天分別進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。集落生成(colonyforming cell，CFC)實(shí)驗(yàn):在甲基纖維素中加入雙抗、IMDM培養(yǎng)基和細(xì)胞，混勻后取1.1 ml接種到直徑為3.5 cm小皿中，37℃培養(yǎng)，2周后進(jìn)行集落計(jì)數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞周期分析 取1×106YFP+的細(xì)胞，70%乙醇固定過夜，加入 RNase A(100 μg·ml-1)，37 ℃孵育30 min，再加入碘化丙啶(40 μg·ml-1)，流式細(xì)胞儀檢測［6］。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測過表達(dá)的蛋白 收集2×106YFP+細(xì)胞，PBS清洗2次，加入蛋白裂解液，冰上裂解15 min，4℃ 14 000×g離心20 min，收集上清，進(jìn)行蛋白定量。蛋白樣品加入5×SDS加樣緩沖液，100℃煮沸5 min，進(jìn)行12%SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，以合適的稀釋比加入一抗4℃搖床過夜，TBST洗滌4次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，最后用 ECL試劑顯影［7］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0處理。結(jié)果以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基因克隆與載體構(gòu)建

如圖1A所示，基因測序結(jié)果證實(shí)我們成功獲得野生型RhoB、脂類修飾缺失的變體RhoBC193G、只進(jìn)行F修飾的變體RhoB-F(C-端殘基CKVL突變?yōu)镃AIM)及只進(jìn)行GG修飾的變體RhoB-GG(C-端殘基CKVL突變?yōu)镃LLL)。并成功構(gòu)建了表達(dá)RhoB及其變體的各類慢病毒載體，目的基因由SFFV(Spleen Focus Forming Virus)啟動子驅(qū)動，YFP報(bào)告基因可示蹤病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(圖1B)。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)顯示RhoB及其變體均獲得了成功表達(dá)(圖1C)。

圖1 基因克隆與載體構(gòu)建A.Gene sequence data;B.Schematic structure of lentiviral vector;C.Western blotting to detect the protein expression Fig 1 Gene cloning and vector construction

2.2 RhoB抑制MEG-01細(xì)胞的增殖

如圖2A所示，過表達(dá)RhoB后，培養(yǎng)第3天Venus組和RhoB組的細(xì)胞增殖并沒有顯著差異，而第6天RhoB組的細(xì)胞生長明顯受到抑制(P＜0.01)。另外，在集落生成實(shí)驗(yàn)中RhoB組的細(xì)胞集落生成能力與Venus組相比受到顯著抑制(P＜0.01)，抑制率約為45%(圖2B)。

圖2 RhoB對MEG-01細(xì)胞增殖能力的影響A.Cell liquid culture;B.Colony-forming cell assayFig 2 The effect of RhoB on MEG-01 cell proliferation

2.3 RhoB抑制CML患者CD34+細(xì)胞的增殖

為了檢測RhoB能否抑制CML病患CD34+細(xì)胞的增殖，隨機(jī)選取3個(gè)CML初診患者的骨髓樣本并純化出CD34+細(xì)胞進(jìn)行集落生成實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖3所示，過表達(dá)RhoB后3個(gè)樣本的集落生成能力與Venus組相比均明顯受到抑制，平均抑制率約為90%。

圖3 RhoB對CML患者CD34+細(xì)胞增殖能力的影響Fig 3 The effect of RhoB on the proliferation of CD34+cells from CML patients

2.4 RhoB抑制MEG-01細(xì)胞生長需要脂類修飾

為了驗(yàn)證RhoB在MEG-01細(xì)胞中行使的抑制功能是否與其蛋白的脂類修飾相關(guān)，我們構(gòu)建了RhoB的脂類修飾缺失變體RhoBC193G。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)RhoBC193G后細(xì)胞生長速度幾乎與Venus組細(xì)胞一致，細(xì)胞總數(shù)無明顯差異(P＞0.05，圖4A)。此外，RhoBC193G與Venus組相比集落生成能力也無顯著差異(P ＞0.05，圖4B)。

圖4 RhoB抑制功能與其脂類修飾相關(guān)性A.Cell liquid culture;B.Colony-forming cell assayFig 4 The association of the inhibitory effect of RhoB with its lipid modification

2.5 F修飾或GG修飾抑制MEG-01細(xì)胞的增殖

為了檢測RhoB在MEG-01細(xì)胞中行使其抑制作用與哪一種脂類修飾相關(guān)，我們在細(xì)胞中過表達(dá)只進(jìn)行F修飾或只進(jìn)行GG修飾的RhoB變體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩種脂類修飾變體單獨(dú)過表達(dá)都可以顯著抑制細(xì)胞的增殖(P＜0.01，圖5A)和集落生成能力(P＜0.05，圖5B)。

圖5 單一脂類修飾對MEG-01細(xì)胞增殖的影響A.Cell liquid culture;B.Colony-forming cell assayFig 5 The effect of mono-lipid modification on the proliferation of MEG-01cells

2.6 RhoB 阻滯MEG-01細(xì)胞于G2/M期

為了初步探索RhoB抑制MEG-01細(xì)胞生長的機(jī)制，我們利用流式細(xì)胞儀檢測過表達(dá)RhoB及其變體后MEG-01細(xì)胞的生長周期進(jìn)程。結(jié)果(圖6)發(fā)現(xiàn)，分別過表達(dá)RhoB或RhoB-F、RhoB-GG后，處于G0/G1期的細(xì)胞與Venus組相比明顯減少(RhoB 34.58%±2.29%，RhoB-F 34.65% ±0.22%，RhoB-GG 39.71% ±1.12%，Venus 46.68% ±0.96%，P＜0.05);而處于G2/M期的細(xì)胞則比Venus組顯著增多(RhoB 30.16% ±2.05%，RhoB-F 33.3% ±1.58%，RhoB-GG 28.75% ±0.50%，Venus 18.21% ±1.59%，P＜0.05)。相比之下，RhoBC193G組無論是處于G0/G1期(47.32% ±0.61%)還是 G2/M期(18.11% ±0.84%)的細(xì)胞百分比基本與Venus組一致。這些結(jié)果說明RhoB將MEG-01細(xì)胞阻滯在G2/M期。

圖6 RhoB及其脂類修飾變體對MEG-01細(xì)胞周期的影響Fig 6 The effect of RhoB and its mutants on the cell cycle of MEG-01 cells

3 討 論

Rho家族成員中RhoB較為特殊。許多Rho蛋白在惡性轉(zhuǎn)化方面起正向調(diào)控作用，而RhoB的功能卻恰恰相反。研究發(fā)現(xiàn)RhoB在尿路上皮細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)顯著降低，并且在肺部腫瘤惡化過程中伴隨有RhoB基因的丟失［8-9］。RhoB基因敲除小鼠出生頻率、發(fā)育和壽命都正常，但是使用DMBA/TPA進(jìn)行化學(xué)處理誘導(dǎo)形成皮膚腫瘤時(shí)，這些小鼠的成瘤率更高［10］。利用裸鼠皮下成瘤模型，在卵巢癌細(xì)胞中過表達(dá)RhoB可以抑制腫瘤的生長［11］。這些結(jié)果說明RhoB在實(shí)體瘤中可能是腫瘤抑制基因。但是RhoB是否在惡性血液病CML中同樣行使抑制功能卻不得而知。通過細(xì)胞增殖和集落生成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CML細(xì)胞中過表達(dá)RhoB后細(xì)胞的增殖受到明顯抑制。結(jié)果表明CML細(xì)胞中RhoB依然行使抑制功能。

RhoB表達(dá)水平因細(xì)胞周期而異，RhoB轉(zhuǎn)錄本半衰期是30 min，這要遠(yuǎn)遠(yuǎn)比Rho蛋白家族其它成員短［12］。這就表明RhoB的功能要求它的表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控。其中一項(xiàng)重要的調(diào)控就是RhoB蛋白的脂類修飾，細(xì)胞中的RhoB蛋白被特異性地進(jìn)行了兩種脂類修飾，F(xiàn)修飾和GG修飾。不同類型的脂類修飾可能導(dǎo)致RhoB蛋白在質(zhì)膜、核膜、晚期內(nèi)涵體等亞細(xì)胞水平不同的定位。RhoB-F蛋白大部分定位在質(zhì)膜上，RhoB-GG蛋白則主要定位在晚期內(nèi)涵體中［13］。一些研究表明RhoB-F、RhoB-GG這兩種脂類修飾形式具有不同的生物學(xué)功能。在Ras轉(zhuǎn)化的小鼠NIH3T3成纖維細(xì)胞中，RhoB和RhoB-GG起到抗轉(zhuǎn)化、抗增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用［14］。而RhoB-F能夠選擇性地維持內(nèi)皮細(xì)胞和經(jīng)輻照處理的細(xì)胞的存活［15-16］。另外，RhoB，RhoB-F和RhoB-GG能抑制胰腺癌、宮頸癌細(xì)胞的生長［5］。本研究中，我們在MEG-01細(xì)胞中過表達(dá)RhoBC193G，發(fā)現(xiàn)失去脂類修飾后，細(xì)胞增殖與Venus組相比并無明顯差異，表明脂類修飾是RhoB抑制MEG-01細(xì)胞增殖所必需的。MEG-01細(xì)胞中分別過表達(dá)RhoB-F和RhoB-GG后細(xì)胞增殖也同樣受到抑制，表明單種脂類修飾仍然能夠維持RhoB在MEG-01細(xì)胞中的抑制功能。另外，細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)RhoB，RhoB-F，RhoB-GG都可將MEG-01細(xì)胞阻滯在G2/M期，而RhoBC193G過表達(dá)的細(xì)胞周期進(jìn)程卻與Venus組細(xì)胞一致，表明RhoB蛋白的脂類修飾影響MEG-01細(xì)胞的周期進(jìn)程，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖。

綜上所述，本研究的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和細(xì)胞機(jī)制分析說明RhoB抑制CML細(xì)胞的生長，并且RhoB蛋白進(jìn)行任何一種脂類修飾均能在CML細(xì)胞中行使抑制功能，同時(shí)經(jīng)過兩種脂類修飾或是單種脂類修飾的RhoB均可阻滯CML細(xì)胞于G2/M期。關(guān)于RhoB如何在MEG-01細(xì)胞中行使抑制功能進(jìn)一步的分子機(jī)制還不明確，深入探索其分子機(jī)制將有助于CML治療方法的研究和靶向藥物的篩選。

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