劉建紅

(天津市第三中心醫(yī)院，天津 300170)

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，因其解剖位置較深和癥狀不明顯，是轉(zhuǎn)移早且確診晚的極具惡性度的腫瘤。由于該腫瘤易復(fù)發(fā)且對(duì)化療藥物存在耐藥性，使得患者5 年生存率很低，僅為30 %左右。卵巢癌80% ～90%來(lái)源于卵巢表面上皮細(xì)胞，其病因不明，一般認(rèn)為與內(nèi)分泌、環(huán)境、遺傳等多方面因素有關(guān)。近些年來(lái)，針對(duì)激素和上皮性卵巢癌(epithelial ovarian carcinoma ，EOC)之間關(guān)系的研究頗多，一般認(rèn)為上皮性卵巢癌為激素依賴性腫瘤，激素在上皮性卵巢癌的病因和輔助治療中發(fā)揮重要作用。隨著分子生物學(xué)和現(xiàn)代免疫學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞因子與腫瘤之間的作用機(jī)制為了解腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移提供了新的思路。本實(shí)驗(yàn)探討促性腺激素、細(xì)胞因子和上皮性卵巢癌的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料人卵巢低分化乳頭狀腺癌細(xì)胞株(OVCAR-3)和人上皮性卵巢癌細(xì)胞株(Caov -3)均購(gòu)自美國(guó)ATCC。OLYMPUS CK2 倒置式生物顯微鏡(日本OLYMPUS)、302 -01 型CO2孵箱(美國(guó)NATIONAL APPLIANCE COMPANY)、Microplate reader Model 550(美國(guó)BIO - RAD COMPANY)。FSH、LH、hrIL-6、抗-IL-6 抗體、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(sigma)購(gòu)自北京舒伯偉公司;二甲基亞砜由蘇州第二化工研究所生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 各取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期卵巢癌細(xì)胞懸液(2 ×105/ml)加入96 孔板中，每孔100 μl，每組6 孔，37 ℃，5%CO2，飽和濕度培育24 h 棄去培養(yǎng)基，更換含有10%活性炭吸附的胎牛血清RPMI 1640 或DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，以去除原胎牛血清所含激素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。加入相應(yīng)的刺激因素:①加入不同終濃度的FSH 和LH(20、40、60、80 和100 IU/L)和不同終濃度FSH+抗IL-6 中和性抗體(50 μg/ml)的培養(yǎng)基200 μl;②加入不同終濃度hrIL -6(20、40、60、80 和100 μg/ml)和hrIL -6 + 抗IL -6 中和性抗體(50 μg/ml)的培養(yǎng)基200 μl。分別設(shè)置6 個(gè)平行對(duì)照孔，另設(shè)6 個(gè)不加藥的細(xì)胞培養(yǎng)基孔作為陰性對(duì)照，37 ℃培育96 h 后，在培養(yǎng)終止前4 h 加入MTT 溶液(5 mg/ml)，每孔20 μl，37 ℃繼續(xù)培育4 h，棄去培養(yǎng)液。

1.2.2 細(xì)胞測(cè)定 在上述細(xì)胞中分別加入二甲基亞砜，每孔100 μl，稍振蕩后，置酶標(biāo)儀上，在波長(zhǎng)為490 nm 時(shí)測(cè)定吸光度(A)值。

1.2.3 計(jì)算細(xì)胞增殖率 細(xì)胞增殖率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔吸光度均值-空白孔吸光度均值)/(對(duì)照孔吸光度均值-空白孔吸光度均值)×100% 。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，試驗(yàn)結(jié)果以±s 表示。用Excel 軟件對(duì)所獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、處理圖表。

2 結(jié)果

2.1 促性腺激素對(duì)卵巢癌細(xì)胞系的促增殖作用及抗IL-6 中和性抗體對(duì)促性腺性激素促增殖作用的影響FSH 可促進(jìn)OVCAR-3、Caov-3 細(xì)胞增殖。當(dāng)FSH濃度為40IU/L 時(shí)，OVCAR-3 細(xì)胞和Caov-3 細(xì)胞株較對(duì)照組細(xì)胞增殖率分別增加了35%和67.7%，兩組比較，差異有顯著意義(P ＜0.05);當(dāng)FSH 濃度為100 IU/L 時(shí)，兩種細(xì)胞增殖率較對(duì)照組細(xì)胞分別增加202%和192%，兩組比較，差異有非常顯著意義(P ＜0.01)。在卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入50 μg/ml 抗IL-6 中和性抗體，兩種卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)均有所減慢，見(jiàn)圖1 和圖2。LH 的結(jié)果與FSH 的結(jié)果類似。無(wú)免疫活性的兔IgG 單獨(dú)與上述兩種細(xì)胞株培育，對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)影響。

2.2 rIL - 6 對(duì)卵巢癌細(xì)胞株的促增殖作用 在hrIL-6終濃度為100ng/ml 時(shí)，OVCAR -3 和Caov -3增殖率分別為對(duì)照組的394%和381%?？笽L -6 中和性抗體可封閉此作用，見(jiàn)圖3。無(wú)免疫活性的兔IgG單獨(dú)與上述兩種細(xì)胞株培育，對(duì)細(xì)胞的增殖均無(wú)影響。

圖1 不同濃度促性腺激素對(duì)OVCAR-3 的促增殖作用

圖2 不同濃度促性腺激素對(duì)Caov-3 的促增殖作用

圖3 hrIL-6 對(duì)卵巢癌細(xì)胞系的促增殖作用

3 討論

1977 年Besedovsky 等［1］提出“神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)”學(xué)說(shuō)，認(rèn)為內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)在功能上是一個(gè)整體，兩組之間互相作用，互相制約，對(duì)肌體功能實(shí)施精密的調(diào)節(jié)，是肌體重要的調(diào)控系統(tǒng)。其共同的調(diào)節(jié)因子就是神經(jīng)肽和激素［2］。為了探索原發(fā)上皮性卵巢癌中神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)功能的變化及其在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用，檢測(cè)了①正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織和惡性卵巢癌組織中促性腺激素受體(FSHR)的表達(dá)情況。②促性腺激素(卵泡刺激素、黃體生成素)、hrIL-6 及抗IL -6 中和性抗體對(duì)卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3，Caov-3 細(xì)胞增殖的影響。③促性腺激素(卵泡刺激素、黃體生成素)、hrIL -6 及抗IL -6 中和性抗體對(duì)卵巢癌細(xì)胞系OVCAR -3 和Caov -3細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB 表達(dá)的影響。

長(zhǎng)期以來(lái)，有兩種關(guān)于卵巢癌發(fā)生的假說(shuō)已逐漸被人們接受，①高促性腺激素假說(shuō):持續(xù)的高促性腺激素對(duì)卵巢上皮的直接刺激或類固醇激素合成后的直接刺激，增加了惡變得可能;②持續(xù)排卵假說(shuō):垂體促性腺激素周期性刺激排卵，造成卵巢上皮反復(fù)損傷，再增殖修復(fù)過(guò)程中有絲分裂對(duì)卵巢上皮的長(zhǎng)期、反復(fù)刺激，最終導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。兩種假設(shè)均在流行病學(xué)上得到支持。流行病學(xué)調(diào)查資料發(fā)現(xiàn):妊娠、哺乳、口服避孕藥可以降低卵巢癌發(fā)生的危險(xiǎn)，這與抑制排卵及垂體促性腺激素分泌有關(guān)。Whittemore［3］發(fā)現(xiàn)使用促排卵藥物的婦女發(fā)生上皮性卵巢癌和交界性卵巢腫瘤的危險(xiǎn)是有不孕史婦女的3 倍和4 倍。促排卵藥物可直接或間接地使促性腺激素超過(guò)生理循環(huán)濃度。性腺發(fā)育不全或兩性畸形患者長(zhǎng)期受高水平促性腺激素的刺激，發(fā)生卵巢癌的幾率也會(huì)增加。另外，使用蓄積促性腺激素釋放激素拮抗劑的方法可以減低或遏制卵巢癌的發(fā)生率，其原理是此種拮抗劑可以抑制促性腺激素得釋放［4］。卵巢癌的高發(fā)期在婦女絕經(jīng)后10 ～20年內(nèi)，而此時(shí)正是體內(nèi)促性腺激素水平分泌升高時(shí)期。據(jù)報(bào)道促性腺激素可促進(jìn)卵巢表面上皮及上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，并在上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤化療耐藥性中扮演重要角色。本研究中外源性 FSH 和 LH 可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞株OVCAR-3和Caov - 3 增殖，這一結(jié)果證實(shí)了上述推斷。

FSH 可參與卵巢上皮分化、增殖、惡性變以及卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［5］。如果改變卵巢癌患者體內(nèi)的內(nèi)分泌環(huán)境，可有助于提高手術(shù)或化療效果，減少?gòu)?fù)發(fā)。而對(duì)高FSH 血癥的絕經(jīng)后婦女的內(nèi)分泌進(jìn)行調(diào)整，有可能減少卵巢癌的發(fā)生。本文選取2 個(gè)卵巢癌細(xì)胞株進(jìn)行促性腺激素體外刺激實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在促性腺激素FSH 和LH 的作用下，細(xì)胞株OVCAR -3 和6Caov -3 的增殖能力加強(qiáng)，呈劑量依賴性，與Viqar Syed 等［6］的研究結(jié)果一致。但也有報(bào)道［7］，在體外實(shí)驗(yàn)中FSH 對(duì)卵巢上皮性腫瘤的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，而LH 卻擁有抑制其生長(zhǎng)的作用，產(chǎn)生這種差異的原因可能是所選用細(xì)胞株的不同。通常人們認(rèn)為FSH 通過(guò)與其細(xì)胞表面G蛋白偶聯(lián)受體FSHR 結(jié)合發(fā)揮對(duì)細(xì)胞的作用。近些年來(lái)，針對(duì)促性腺激素在上皮性卵巢癌中的調(diào)控機(jī)制研究頗多，發(fā)現(xiàn)促性腺激素可通過(guò)調(diào)節(jié)一些細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和蛋白激酶等對(duì)上皮性卵巢癌發(fā)揮調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)著重探討在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中促性腺激素和IL-6 的作用。

Viqar Syed 等［6］研究證實(shí)，利用促性腺激素刺激卵巢癌細(xì)胞株可增加細(xì)胞IL -6 及IL -6 受體的表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其增殖加快，而且IL-6 抗體抑制這種促增殖作用。本實(shí)驗(yàn)雖然與Viqar Syed 等人所使用的細(xì)胞株不同，但也得出類似結(jié)果，說(shuō)明IL -6 在卵巢癌細(xì)胞的增殖過(guò)程中起重要作用。IL -6 是一種具有多向性生物學(xué)效能的細(xì)胞因子，如誘導(dǎo)B 細(xì)胞分化和分泌抗體，激活T 細(xì)胞和造血細(xì)胞，誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子產(chǎn)生等。正常卵巢上皮可持續(xù)分泌IL -6，在卵巢濾泡發(fā)育、周圍血管鞘形成過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞可表達(dá)IL -6 mRNA，介導(dǎo)血管形成;在周期性排卵過(guò)程中，IL -6 可刺激上皮增生，參與卵巢表面破裂口的修復(fù)過(guò)程［8］?；A(chǔ)研究證實(shí)，在卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中可測(cè)出IL-6 活性及IL-6 受體(IL-6R)mRNA 表達(dá)，并可刺激細(xì)胞的增殖［9］，本研究證實(shí)了這一點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)外源性hrIL-6 可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞株OVCAR -3 和Caov -3的增殖。

總之，上皮性卵巢癌的發(fā)生與患者體內(nèi)促性腺激素水平的異常升高以及各種細(xì)胞因子比例失衡有著密切的聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)觀察到促性腺激素及IL -6 對(duì)卵巢癌細(xì)胞系OVCAR -3 和Caov -3 具有促細(xì)胞增殖作用，另一個(gè)發(fā)現(xiàn)是抗白細(xì)胞介素-6 中和性抗體可部分抑制上述促細(xì)胞增殖。這些結(jié)果提示:體內(nèi)促性腺激素異常升高在上皮性卵巢腫瘤形成的早期起到重要的作用，而一旦上皮性卵巢癌形成，激素與細(xì)胞因子共同影響其發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。

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