馮曉華 龍孝斌 汪建 陳勇挺

目前，手機(jī)通訊已成為人們信息交流的主要工具之一，其電磁微波輻射可能對人們的健康構(gòu)成潛在的威脅。近年來，手機(jī)微波輻射對大腦及中樞神經(jīng)系統(tǒng)可能產(chǎn)生的影響備受研究者關(guān)注［1］。本研究擬通過建立模擬手機(jī)微波輻射豚鼠模型，分離豚鼠單個(gè)活的耳蝸外毛細(xì)胞（outer hair cell，OHC），在2 000Hz不同強(qiáng)度的純音刺激下，觀察單個(gè)離體豚鼠耳蝸OHC膜電位的變化及規(guī)律，探討手機(jī)微波輻射對聽覺功能可能產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 選用成年健康雜色豚鼠20只，體重280～350g，雌雄不分，耳廓反射正常，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。豚鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)10天后，隨機(jī)分為對照組、輻射組，每組各10只。

1.2 檢測儀器 ACAS 570 粘附式細(xì)胞儀（美國Meridian公司生產(chǎn)）；丹麥產(chǎn)Madson純音測聽儀；DIBAC4（3）熒光探針（美國Sigma公司產(chǎn)品，細(xì)胞膜特異性熒光探針）。

1.3 手機(jī)微波輻射裝置及輻射方法 手機(jī)通信頻率為900 MHz，功率密度為0.05 mW／cm2。將輻射組豚鼠限制于自制的籠中，將手機(jī)聽筒放置于豚鼠的耳部，距離豚鼠耳廓2cm，以便及時(shí)調(diào)整并模擬人通話的狀態(tài)。接通手機(jī)后輻射時(shí)間分別為1、6、12、24和48h（各2只豚鼠），對照組豚鼠除不進(jìn)行手機(jī)輻射外，其余處理均與輻射組相同。

1.4 實(shí)驗(yàn)溶液的配制

1.4.1 Hepes 液的配制（mmol／L） NaCl 133，KCl 5.4，Hepes 5，Glucose 5，CaCl21.3，MgSO40.9，配制時(shí)準(zhǔn)確稱量后采用三蒸水配制，用1N 的NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.4，4mol／L NaCl將其滲透壓調(diào)節(jié)為300mmol／L。

1.4.2 IV 膠原酶液的配制 采用美國Sigma公司生產(chǎn)的IV 膠原酶，用Hepes液配制成濃度為0.5 mg／ml備用。

1.4.3 多聚賴氨酸粘附劑的配制 采用美國Sigma公司生產(chǎn)的多聚賴氨酸（poly－1－lysine），用三蒸水配制成0.25mg／ml溶液，取50μl加入ACAS 570專用培養(yǎng)皿中，無菌條件下風(fēng)干備用。

1.4.4 DIBAC4（3）熒光探針的配制 取DIBAC4（3）25μl（1mg／ml）加入Hepes液至10ml即成5 μM 液，避光冷藏備用。

1.5 OHC的分離及染色 在5個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)分別隨機(jī)活殺兩組中的2只豚鼠，于2分鐘內(nèi)取出聽泡，浸于Hepes液中，在解剖顯微鏡下分離出第2～4回基底膜，用微量加樣器吸取分離出的基底膜于玻璃試管中，加入等量的0.5 mg／ml IV 膠原酶（Sigma，用Hepes液配制，終濃度為0.25mg／ml），輕輕吹打5次，靜置10分鐘后用Hepes液洗滌3次；微量加樣器加入5μM 的DIBAC4（3）避光染色20分鐘；離心去除上清液。吸取50μl細(xì)胞懸液加入含有薄層多聚賴氨酸的特制培養(yǎng)皿中（Sigma，用三蒸水配成0.25mg／μl，50μl加入培養(yǎng)皿中，無菌風(fēng)干備用），靜置5分鐘。將培養(yǎng)皿置于ACAS 570載物臺上，顯微鏡下選取活性良好的OHC［2］進(jìn)行檢測。

1.6 OHC膜電位的檢測 選取活性良好的OHC，在靜息狀態(tài)下先掃描40秒后，將純音測聽儀輸出耳機(jī)距培養(yǎng)皿約10cm 高，由上而下對準(zhǔn)培養(yǎng)皿底部，采用2 000Hz純音，分別于掃描第40、70、100、140、170、200、225、240 及275s時(shí)予10、20、30、40、50、60、70、80及100dB HL純音刺激，每次持續(xù)3s，于100dB HL 時(shí)持續(xù)刺激60s，觀察OHC 內(nèi)熒光值的改變。上述實(shí)驗(yàn)于室溫下（20～25 ℃）1小時(shí)內(nèi)完成，以確保OHC的良好活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。豚鼠的離體單個(gè)OHC 首次聲刺激的去極化時(shí)間、首次去極化膜電位水平（熒光值）采用±s表示；對照組和輻射組之間的比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 靜息狀態(tài)下離體OHC熒光值特征 DIBAC4（3）為一種親陽離子的陰離子染料探針，其跨膜分布依賴于膜電位。在靜息狀態(tài)下OHC 呈現(xiàn)試管狀，DIBAC4（3）均勻、無規(guī)則分布于整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中，胞漿的兩極相對集中，周邊較弱（圖1、2）。

2.2 對照組OHC膜電位變化規(guī)律 對照組豚鼠的離體單個(gè)OHC 在2 000 Hz不同強(qiáng)度純音刺激下，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度呈不同程度的增高（曲線上升），而刺激間歇時(shí)，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度亦開始回落（曲線下降），伴隨聲刺激的持續(xù)和間斷，曲線亦呈現(xiàn)上升、下降、再上升和再下降之變化規(guī)律，即OHC 產(chǎn)生去極化、復(fù)極化、再去極化和再復(fù)極化改變。圖3提示：予2 000Hz、10dB HL 純音聲刺激OHC 時(shí)，第40 s細(xì)胞內(nèi)熒光值開始升高，并于第50s達(dá)到峰值（1.112u），隨后細(xì)胞內(nèi)熒光值開始回落，于第60s至最低值（1.000u）。表明對照組OHC 首次去極化時(shí)間為10s，并于10s內(nèi)完成復(fù)極化。

2.3 輻射組OHC 膜電位變化規(guī)律 輻射組手機(jī)微波輻射后1 小時(shí)檢測結(jié)果表明，予2 000 Hz、10 dB HL純音刺激OHC時(shí)，第40s細(xì)胞內(nèi)熒光值亦開始升高，第65s達(dá)到峰值（1.100u），隨后細(xì)胞內(nèi)熒光值開始回落，至第二次聲刺激（第70s、20dB HL）開始時(shí)回落至1.045u。以后連續(xù)3次聲刺激時(shí)曲線有微上升，但都未能達(dá)到峰值和完全回落，提示手機(jī)微波輻射1小時(shí)后，OHC細(xì)胞膜的去極化和復(fù)極化時(shí)間明顯延長且不能完全去極化和復(fù)極化（圖4）。輻射6小時(shí)和12小時(shí)后，隨著間斷的聲刺激可見OHC內(nèi)熒光值緩慢上升，輻射6 小時(shí)組之毛細(xì)胞于第70s熒光值達(dá)峰值（1.100u），而輻射12小時(shí)組之毛細(xì)胞于第90s熒光值達(dá)峰值（1.050 u），隨后整條曲線呈微上升趨勢（圖5、6）。輻射24和48小時(shí)后，經(jīng)過聲刺激，曲線呈微上升、微下降波動，無明顯峰值及回落（圖7）。提示經(jīng)手機(jī)微波連續(xù)輻射24小時(shí)后，OHC無明顯去極化和復(fù)極化過程。

2.4 首次聲刺激OHC 膜電位熒光峰值變化規(guī)律 手機(jī)微波輻射1、6、12、24和48小時(shí)后，離體豚鼠OHC首次聲刺激后膜電位熒光峰值較對照組顯著降低（P＝0.000，P＜0.01）。輻射后1小時(shí)和6小時(shí)兩組相比較，OHC首次聲刺激后的膜電位熒光峰值水平差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.129，P＞0.05），且OHC膜電位熒光值水平均為1.00u（圖4，5）。隨輻射時(shí)間的延長，首次聲刺激后OHC 膜電位熒光峰值水平逐漸下降，輻射時(shí)間越長，下降越明顯。

2.5 首次聲刺激OHC 去極化時(shí)間變化規(guī)律 手機(jī)微波輻射1、6、12小時(shí)后，OHC 首次去極化時(shí)間較對照組顯著延長（P＝0.000，P＜0.01）；隨著輻射時(shí)間的延長，OHC去極化時(shí)間明顯延長，輻射12小時(shí)后，去極化時(shí)間最長；輻射后各組與對照組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.000，P＜0.01）；輻射24和48小時(shí)后，膜電位僅呈輕微、不規(guī)律的波動，沒有明顯的去極化過程（表1）。

表1 首次聲刺激后各組OHC膜電位熒光峰值和去極化時(shí)間（膜電位水平）（±s）

表1 首次聲刺激后各組OHC膜電位熒光峰值和去極化時(shí)間（膜電位水平）（±s）

組別膜電位的熒光值（u）去極化時(shí)間（s）1.112±0.002 9.92±0.16輻射組 輻射1小時(shí)1.087±0.116 24.97±0.18 輻射6小時(shí)1.081±0.014 30.49±0.98 輻射12小時(shí)1.046±0.003 50.00±1.27 輻射24小時(shí)1.021±0.007— 輻射48小時(shí)1.021±0.007對照組—

圖1 靜息狀態(tài)下對照組離體OHC形態(tài)及DIBAC4（3）熒光分布圖2 靜息狀態(tài)下輻射組輻射1h離體OHC形態(tài)及DIBAC4（3）熒光分布圖3 2 000Hz聲刺激后對照組OHC熒光值變化曲線

圖4 2 000Hz聲刺激后輻射1h組OHC熒光值變化曲線圖5 2 000Hz聲刺激后輻射6h組OHC熒光值變化曲線圖6 2 000Hz聲刺激后輻射12h組OHC熒光值變化曲線圖7 2 000Hz聲刺激后輻射24、48h組OHC熒光值變化曲線

3 討論

手機(jī)電磁輻射屬于微波波段，頻率為800～2 000 MHz。手機(jī)微波輻射能量以脈沖式重復(fù)遞增，其頻率高、波長短，對生物體的影響較大。目前使用最為普遍的手機(jī)是采用全球定位系統(tǒng)的數(shù)字手機(jī)，中心頻率為900 MHz，通過微波的微小調(diào)制來傳輸語音信息。有研究者［2］發(fā)現(xiàn)，電磁輻射對人體的作用主要是非熱效應(yīng)，并指出這與神經(jīng)系統(tǒng)方面的異常表現(xiàn)有關(guān)，電磁輻射對兒童的免疫功能和神經(jīng)系統(tǒng)影響更為突出。Monfrecola等［3］用手機(jī)輻射志愿者的耳部，然后測定皮膚的血流量，發(fā)現(xiàn)手機(jī)輻射組的血流量較對照組顯著升高。Moustafa等［4］試驗(yàn)表明暴露于手機(jī)輻射場中1、2、4小時(shí)后，血漿中油脂過氧化物水平顯著增高，自由基清除劑超氧化物歧化酶活性顯著降低。有實(shí)驗(yàn)室采用大白鼠模型來研究手機(jī)輻射的促癌作用，結(jié)論認(rèn)為長時(shí)間、高頻率使用移動電話能提高誘發(fā)腦部惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，并且顳葉的腫瘤尤為明顯，其中又以聽神經(jīng)瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)最高［5］。使用手機(jī)時(shí)通常是靠近或緊貼耳部，因此聽覺系統(tǒng)被認(rèn)為是最有可能受到影響的器官之一［6］。

耳蝸OHC的運(yùn)動可增強(qiáng)基底膜振諧曲線對特征頻率的敏銳度，對內(nèi)毛細(xì)胞有驅(qū)動效應(yīng)作用，并間接影響內(nèi)毛細(xì)胞對振動刺激信號的敏感性。這表明OHC及其膜電位在人類聽覺生理中具有重要作用，其生理功能狀態(tài)對聽覺功能有直接的影響。當(dāng)耳蝸受到聲刺激時(shí)，在耳蝸及其附近結(jié)構(gòu)可記錄到一種特殊的電波動，通常稱之為微音電位［7］，這是一種由聲刺激誘發(fā)的、起源于許多OHC 且存在于細(xì)胞外的感受器交流總和電位，耳蝸微音電位主要來源是OHC（占80%～85%），而小部分來源于IHC（15%～20%）［8］。電阻調(diào)制學(xué)說認(rèn)為毛細(xì)胞頂部的膜內(nèi)、外存在著約140mV 的巨大電位差，OHC 膜可能起著一個(gè)可變電阻器的作用，其阻值隨著聽纖毛向不同方向的彎曲和復(fù)位而增大或減少，造成膜電阻的相應(yīng)波動，在膜兩側(cè)形成一個(gè)波動式的電壓變化，對原有的毛細(xì)胞靜息電位（－60 mV）和內(nèi)淋巴電位（＋80mV）進(jìn)行調(diào)制。當(dāng)耳蝸毛細(xì)胞受到機(jī)械刺激興奮后，產(chǎn)生耳蝸微音電位，傳入神經(jīng)的谷氨酸遞質(zhì)釋放激活鈣離子通道，引起蝸神經(jīng)末梢興奮產(chǎn)生動作電位，上傳至大腦皮層產(chǎn)生聽覺［8］。OHC膜電位的大小及變化決定了微音電位的大小及變化規(guī)律［9］。本研究中OHC膜電位改變的機(jī)理可能是微波輻射引起OHC 的鈣通道激活，使得鈣離子通透性增加并通過OHC 的胞膜內(nèi)流，使鈉－鈣交換受到抑制，胞內(nèi)鈣離子的增加改變了OHC 的膜電位和能動性。

耳蝸的聽覺過程是一個(gè)從機(jī)械刺激到發(fā)放神經(jīng)沖動的環(huán)節(jié)，耳蝸向聽覺中樞提供精確的聽覺信息，使中樞對聽覺信息進(jìn)行精細(xì)處理并對聽敏度起著關(guān)鍵的作用。本實(shí)驗(yàn)采用ACAS 570粘附細(xì)胞儀、DIBAC4（3）熒光探針為檢測手段，以2 000Hz不同強(qiáng)度純音刺激作用于離體狀態(tài)下活OHC，動態(tài)觀察OHC膜電位的變化規(guī)律。ACAS 570 為粘附式細(xì)胞分析及篩選激光顯微鏡，具有高分辨率，可用于活細(xì)胞的功能研究，如細(xì)胞內(nèi)染色體、pH 值、離子濃度和膜電位測定等。DiBAC4（3）是一種膜電位敏感的親脂性陰離子熒光染料，該染料于去極化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加；復(fù)極化時(shí)從細(xì)胞內(nèi)移出，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度降低。根據(jù)其在細(xì)胞內(nèi)、外的重新分布，可判斷出細(xì)胞膜電位的變化［10］。本實(shí)驗(yàn)中DiBAC4（3）熒光值與膜電位的對應(yīng)關(guān)系為：第40s予2 000Hz、10dB HL 純音刺激OHC 時(shí)，細(xì)胞內(nèi)熒光值開始升高，第50s達(dá)到峰值（1.112u），刺激間歇期細(xì)胞內(nèi)熒光值開始回落，第60s至最低值（1.000u），即OHC完全去極化時(shí)之膜電位所對應(yīng)的熒光值為1.112u，而完全復(fù)極化時(shí)膜電位所對應(yīng)的熒光值為1.000u。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：當(dāng)予2 000Hz不同強(qiáng)度純音聲刺激對照組OHC 時(shí)，OHC產(chǎn)生規(guī)律性的去極化、復(fù)極化、再去極化和再復(fù)極化改變；手機(jī)微波輻射1小時(shí)后，OHC 細(xì)胞膜的去極化和復(fù)極化時(shí)間明顯增加，并且不能完全去極化和復(fù)極化；輻射時(shí)間超過6小時(shí)后，伴隨聲刺激曲線呈微上升、微下降波動，無明顯峰值及回落。提示手機(jī)微波連續(xù)輻射6小時(shí)后，OHC無明顯去極化和復(fù)極化過程，去極化的峰值明顯降低，動作電位產(chǎn)生的峰值也降低；當(dāng)輻射時(shí)間大于24h時(shí)，聲刺激后OHC基本不能出現(xiàn)膜電位變化。產(chǎn)生此結(jié)果的原因可能是由于手機(jī)微波輻射改變了OHC 膜表面的跨膜蛋白結(jié)構(gòu)，并進(jìn)而影響OHC 膜離子通透性及跨膜電位的形成［11］。

綜上所述：長時(shí)間的手機(jī)微波輻射能引起離體豚鼠耳蝸OHC膜離子通透性的改變，影響OHC膜電位的形成及細(xì)胞去極化、復(fù)極化，從而導(dǎo)致離體OHC膜電位對不同強(qiáng)度純音刺激的敏感性逐漸降低。至于手機(jī)微波輻射如何改變以及改變何種離子通透性，則有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)不足之處是，2 000Hz不同強(qiáng)度純音刺激由空氣介質(zhì)進(jìn)入水溶液介質(zhì)時(shí)，將產(chǎn)生一定的折射損耗，作用于OHC的刺激強(qiáng)度有所減弱。因此，應(yīng)進(jìn)一步改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法和手段，以獲得更加接近于生理狀態(tài)下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

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