張巨波 郭坤 陳漪 葛寧靈 任正剛

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝腫瘤內(nèi)科，上海 200032）

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3抑制劑WP1066對肝細(xì)胞肝癌生物學(xué)特性影響的研究

張巨波 郭坤 陳漪 葛寧靈 任正剛

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝腫瘤內(nèi)科，上海 200032）

目的:探討信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的抑制劑 WP1066在體外對人肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）增殖、侵襲能力的影響以及在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)對HCC的抑制效果。方法:采用蛋白印跡、Transwell等方法檢測在不同惡性潛能的人HCC細(xì)胞株中STAT3總蛋白及磷酸化水平的差異，觀察應(yīng)用WP1066后人HCC細(xì)胞株MHCC－97 H的增殖以及侵襲能力的改變。皮下接種MHCC－97 H細(xì)胞株建立裸鼠的HCC模型后，觀察WP1066對腫瘤生長的影響。結(jié)果:STAT3磷酸化水平在惡性潛能高的人HCC細(xì)胞株中顯著高于惡性潛能低的HCC細(xì)胞株；WP1066能顯著抑制MHCC－97H的增殖和侵襲。在裸鼠HCC模型中，WP1066能有效地抑制HCC生長。結(jié)論:WP1066能抑制STAT3磷酸化水平而有效抑制HCC增殖和侵襲。

肝癌； 抑制劑； 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3； 增殖； 侵襲

原發(fā)性肝癌居世界惡性腫瘤死因第3位，居我國惡性腫瘤死因第2位。在我國，該病的主要類型是肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC），占原發(fā)性肝癌的90%以上［1］。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在細(xì)胞因子和生長因子信號通路中發(fā)揮重要作用［2］。STAT3激活可影響細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等，可上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)，它也是反映腫瘤預(yù)后的標(biāo)志［3］。STAT3作為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)受到了廣泛的關(guān)注［4］。本研究旨在探討STAT3抑制劑WP1066對人HCC生物學(xué)特性的影響及其在體內(nèi)對HCC生長的抑制作用。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞株

人HCC細(xì)胞株Hep3B、Hep G2購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物收藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），人HCC細(xì)胞株 MHCC－97L和MHCC－97 H由復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所建立并保存。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Hep3B用含10%熱滅活胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，Hep G2、MHCC－97L和 MH－CC－97H用含10%熱滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞生長至80%密度時(shí)用0.125%胰蛋白酶消化并傳代。MEM、DMEM培養(yǎng)液和特級胎牛血清均由Gibco公司生產(chǎn)。

1.3 蛋白印跡 按常規(guī)方法進(jìn)行。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將對數(shù)生長期MHCC－97H細(xì)胞以5×104個(gè)/m L密度接種于96孔板（100μL/孔），WP1066按0.5μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L、4.0μmol/L、6.0μmol/L分別給藥，以0.9%氯化鈉液干預(yù)的設(shè)為對照組，每組設(shè)4個(gè)副孔。連續(xù)培養(yǎng)72 h后，每孔加入20μL甲基四氮唑鹽（methyl tetrazolium salt，MTS），并于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育90 min。用酶標(biāo)儀（波長490 nm）測量吸光值。

1.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

在 WP1066干預(yù)48 h后的MHCC－97 H細(xì)胞中，取5×104個(gè)細(xì)胞，加入鋪有基底膜基質(zhì)膠（basement membrane matrix，Matrigel）的Transwell上室，使總體積為100μL，在下室加入600μL條件培養(yǎng)液后于37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，甲醛固定，結(jié)晶紫染色。在200倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野穿膜細(xì)胞數(shù)目，取其平均值。

1.6 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 試 驗(yàn) （enzyme－linked immu－nosorbent assay，ELISA）

人VEGF－ELISA試劑盒購自R＆D公司，按試劑說明書方法檢測，測定結(jié)果用酶標(biāo)儀（主波長450 nm，輔助波長630 nm）讀取光密度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得VEGF的相對含量。

1.7 構(gòu)建皮下人 HCC模型

雄性BALB/C－nu/nu裸小鼠，4～6周齡，12只，體質(zhì)量15～18 g，購自國家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心上海分公司。在恒溫（24～27℃）、恒濕（45%～50%）、無特異病原菌環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，將水和飼料滅菌處理后供裸小鼠自由攝入。用0.125%胰酶消化對數(shù)生長期MHCC－97H細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度（3×107個(gè)/m L），取0.2 m L接種于裸小鼠右前肢腋部皮下，接種10 d后將其隨機(jī)分為對照組（0.9%氯化鈉液灌胃）和 WP1066治療組［40 mg/（kg·d）灌胃］，灌5 d停2 d，連續(xù)給藥6周。每周測量皮下腫瘤長短徑，根據(jù)體積＝長徑×短徑2×π/6計(jì)算腫瘤體積。給藥6周后采集外周血，分離腫瘤并稱其質(zhì)量。

2 結(jié) 果

2.1 不同轉(zhuǎn)移潛能HCC細(xì)胞株中STAT 3總蛋白及其磷酸化水平的檢測

采用蛋白印跡方法檢測Hep3B、HepG2、MHCC－97L、MHCC－97H 中STAT 3的總蛋白和磷酸化水平，結(jié)果顯示STAT3總蛋白在各細(xì)胞株中的表現(xiàn)無顯著差異，而STAT3磷酸化水平在轉(zhuǎn)移潛能高的 MHCC－97H細(xì)胞株中顯著升高，提示STAT3的磷酸化水平與HCC細(xì)胞的惡性生物學(xué)表型相關(guān)，見圖1。

圖1 STAT3在HCC細(xì)胞株中的磷酸化水平

2.2 WP1066體外對 MHCC－97H增殖和侵襲能力的影響

用0.5μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L、4.0μmol/L、6.0μmol/L的 WP1066干預(yù) MHCC－97 H細(xì)胞株48 h后，檢測STAT3的磷酸化水平，結(jié)果顯示高濃度 WP1066能顯著抑制STAT3磷酸化水平，見圖2。采用2μmol/L和6μmol/L兩個(gè)濃度的WP1066干預(yù)MHCC－97H，在不同時(shí)間點(diǎn)檢測細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示W(wǎng)P1066對HCC細(xì)胞增殖的抑制成劑量依賴性，較高劑量的WP1066能有效抑制HCC細(xì)胞增殖，見圖3A。取WP1066干預(yù)48 h的 MHCC－97H，檢測其侵襲能力的變化，結(jié)果顯示 WP1066能顯著抑制MHCC－97 H的侵襲能力，見圖3B。

圖2 WP1066對MHCC－97H細(xì)胞株中STAT3磷酸化水平的抑制作用成劑量依賴性

2.3 WP1066對裸鼠成瘤的抑制作用

注射MH－CC－97 H在裸鼠皮下成瘤后，用 WP1066［40 mg/（kg·d）］灌胃。每周測量腫瘤體積1次。6周后獲取腫瘤并稱質(zhì)量；采集外周血檢測VEGF濃度；提取腫瘤組織中總蛋白并檢測缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF－1α）的表達(dá)。結(jié)果顯示，WP1066治療組的腫瘤體積［（1085.8±220.1）mm3］和質(zhì)量［（1.50±0.33）g］均顯著小于對 照 組 ［（1525.4±324.6）mm3和 （2.16±0.34）g，P＜0.05］，說明 WP1066可以有效地抑制HCC的生長。WP1066治療組HIF－1α表達(dá)下調(diào)，且該組外周血 VEGF［（55.0±18.9）pg/m L］顯著低于對照組［（93.8±18.7）pg/m L］（P＝0.012），見圖4。

3 討 論

STAT3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子家族的重要成員之一，它在細(xì)胞內(nèi)起著重要的信號傳遞作用，能被很多細(xì)胞因子和生長因子激活，繼而發(fā)生二聚體化進(jìn)入到細(xì)胞核，與下游靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的特異位點(diǎn)結(jié)合后調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，從而在細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和血管生成以及免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用［3，5－7］?，F(xiàn) 有 的 研 究［2－3］提 示，STAT3 是 一 個(gè)癌基因，它的異常活化對惡性腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移起關(guān)鍵作用，并與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有密切的關(guān)系。

本研究顯示，在具有不同侵襲和轉(zhuǎn)移潛能的HCC細(xì)胞株 Hep3B、Hep G2、MHCC－97 H 和 MHCC－97L中STAT3總蛋白水平無顯著差異，但其在MHCC－97H細(xì)胞株中的磷酸化水平顯著升高，提示STAT3磷酸化水平和HCC細(xì)胞的惡性表型有一定的相關(guān)性。體外應(yīng)用STAT3抑制劑WP1066干預(yù)HCC細(xì)胞株，結(jié)果顯示W(wǎng)P1066對HCC細(xì)胞株中STAT3磷酸化水平的抑制呈劑量依賴性，這與其他腫瘤研究中關(guān)于STAT3機(jī)制的報(bào)道一致［8－9］。2μmol/L的 WP1066可以部分抑制HCC細(xì)胞增殖，但和對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；6μmol/L WP1066則可以顯著地抑制HCC細(xì)胞的增殖和侵襲。

HCC患者常伴有肝硬化，使之難以耐受化療。因此，迫切需要尋找新的針對HCC的靶向治療藥物，使其在充分發(fā)揮抗腫瘤作用的同時(shí)而不對機(jī)體產(chǎn)生不良影響。本研究證實(shí)，采用40 mg/（kg·d）的WP1066可以抑制HCC的生長，且對裸鼠體質(zhì)量無顯著影響。

綜上所述，STAT3信號通路在HCC的增殖和侵襲過程中發(fā)揮著重要的作用，STAT3抑制劑WP1066有望成為一種新的分子靶向藥物。STAT3是如何與其他信號通路的關(guān)鍵分子聯(lián)合發(fā)揮作用的則還有待于進(jìn)一步研究。

［1］Chen M，Therneau T，Orsini LS，et al.Design and rationale of the HCC BRIDGE study in China:a longitudinal，multicenter cohort trial in hepatocellular carcinoma［J］.BMC Gastroenterol，2011，11（5）:53.

［2］Levy DE，Inghirami G.STAT3:a multifaceted oncogene［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（27）:10151－10152.

［3］Niu G，Wright KL，Huang M，et al.Constitutive Stat3 activity up－regulates VEGF expression and tumor angiogenesis［J］.Oncogene，2002，21（13）:2000－2008.

［4］Liu Y，F(xiàn)uchs J，Li C，et al.IL－6，a risk factor for hepatocellular carcinoma:FLLL32 inhibits IL－6－induced STAT3 phosphorylation in human hepatocellular cancer cells［J］.Cell Cycle，2010，9（17）:3423－3427.

［5］Matsui T，Kinoshita T，Hirano T，et al.STAT3 down－regulates the expression of cyclin D during liver development［J］.J Biol Chem，2002，277（39）:36167－36173.

［6］Kesanakurti D，Chetty C，Dinh DH，et al.Role of MMP－2 in the regulation of IL－6/Stat3 survival signaling via interaction with alpha5beta1 integrin in glioma［J］.Oncogene，2012，29（49）:6152－6160.

［7］Yu H，Kortylewski M，Pardoll D.Crosstalk between cancer and immune cells:role of STAT3 in the tumour microenvironment［J］.Nat Rev Immunol，2007，7（1）:41－51.

［8］Horiguchi A，Asano T，Kuroda K，et al.STAT3 inhibitor WP1066 as a novel therapeutic agent for renal cell carcinoma［J］.Br J Cancer，2010，102（11）:1592－1599.

［9］Hatiboglu MA，Kong LY，Wei J，et al.The tumor microenvironment expression of p－STAT3 influences the efficacy of cyclophosphamide with WP1066 in murine melanoma models［J］.Int J Cancer，2011，130（7）:2812－2823.

Effects of an Inhibitor of Signal Transducer and Activator of Transcription 3，WP 1066，on the Biological Characteristics of Hepatocellular Carcinoma

ZHANG Jubo GUO Kun CHEN Yi GE Ningling

REN Zhenggang Department of Hepatic Oncology，Zhongshan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，China

Objective:To explore the effects of an inhibitor of signal transducer and activator of transcription 3 （STAT3），WP1066，on the proliferation and invasion of hepatocellular carcinoma（HCC）cells in vitro and in vivo.Methods:The expression level and phosphorylation level of STAT3 in HCC cell lines with different malignant potential were detected by Western blotting and Transwell method.The antitumor activities of WP1066 and related mechanisms were studied in HCC cell line MHCC－97H and also in a subcutaneous HCC model in nude mice.Results:STAT3 phosphorylation level was significantly higher in HCC cell lines with higher malignant potential.WP1066 significantly inhibited cell proliferation and invasion in MHCC－97H.WP1066 also significantly inhibited the growth of tumor in nude mice HCC model.Conclusions:WP 1066 can suppress the proliferation and invasion of HCC through inhibition of the phosphorylation level of STAT3.

Hepatocellular carcinoma； Inhibitor； Signal transducer and activator of transcription 3； Proliferation； In－vasion

R735.7

A

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號:30872505、81172275）

任正剛，E－mail:ren.zhenggang＠zs－h(huán)ospital.sh.cn