王俊英,張 杰

(周口師范學院生命科學系,河南周口466001)

酸奶是將乳酸菌接種到滅菌的新鮮牛乳中進行發(fā)酵所得的一種乳制品,因其風味獨特,口感好,營養(yǎng)豐富,對人體健康有重要作用,深受廣大消費者的青睞。目前在國外成熟的乳品市場,酸奶的比例一般會達到40%左右。國內酸奶僅占整個乳品市場份額的15%左右,市場潛力非常大,有將近兩倍左右的上升空間。面對這樣的形勢,對酸奶中乳酸菌的研究成了研究的熱點。嗜熱鏈球菌是酸奶中唯一的一種球菌,目前,嗜熱鏈球菌的分離和鑒定[1-2]、嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的相互作用是研究的重點[3]。

本試驗利用平板劃線法從酸奶樣品中分離出嗜熱鏈球菌,對其形態(tài)特征進行觀察,并對其進行生長測試、耐鹽測試、凝固性測試、產酸測試、糖發(fā)酵測試、明膠水解測試和過氧化氫酶測試,從這些指標里挑選出性能好的菌株。為進一步研究保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的相互作用奠定基礎。

1 試驗材料

1.1 試驗樣品

蒙牛益生菌活性酸奶(含嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌),花花牛益生菌活性酸牛奶(含嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌),光明益生菌活性酸牛奶(含嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌)。

1.2 試驗試劑

1.2.1 試驗所用培養(yǎng)基

改良M17瓊脂培養(yǎng)基:胰蛋白胨5.0 g,魚肉浸出液5.0 g,牛肉膏5.0 g,酵母浸膏2.5 g,抗壞血酸0.5 g,硫酸鎂0.25 g,甘油10.0 g,乳糖3.0 g,磷酸氫二鉀5.0 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 000 m L,p H為6.4。糖發(fā)酵基礎培養(yǎng)基[3],明膠培養(yǎng)基[4]。

1.2.2 試驗藥品

500 m L無菌水,革蘭氏染色液,3%過氧化氫溶液,500 m L新鮮脫脂乳,0.1 mol/L NaOH溶液,1.6%溴甲酚紫,氯化鈉,2%酚酞試劑。

1.3 試驗儀器

JD200-3型電子天平,電熱壓力蒸汽滅菌器,HZQF250A型高低溫恒溫培養(yǎng)箱,JNOEC XSP-24N型顯微鏡(上海博迅實業(yè)有限公司)。

2 試驗方法

2.1 酸奶中嗜熱鏈球菌的分離[5]

2.1.1 配制改良M17瓊脂培養(yǎng)基

把配制好的改良M17瓊脂培養(yǎng)基,分裝入錐形瓶內,在0.1 MPa下滅菌20 min。

2.1.2 菌懸液的配制

取6支無菌潔凈試管,各盛9 mL無菌生理鹽水,將蒙牛酸奶樣品攪拌均勻,用移液管取1 m L加入第1支試管中,震蕩均勻即成蒙牛10-1稀釋液,再用移液管取10-1菌懸液1 m L放入第2支試管中,震蕩均勻即可得到10-2蒙牛稀釋液,依此可得到蒙牛10-3、10-4、10-5、10-6稀釋液,照此方法制備其他兩種樣品的菌懸液。

2.1.3 接種

每個樣品每個濃度取0.05 m L涂布于標有該樣品濃度的培養(yǎng)基平皿中,37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d。

2.1.4 純化

對培養(yǎng)出的菌落進行觀察,在各個樣品中挑選出不同的菌落,標上序號,無菌操作條件下用平板劃線法接種到培養(yǎng)基上,在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d,進行第一次純化。照此方法進行第二次純化。

2.2 酸奶中嗜熱鏈球菌的鑒定[6-8]

2.2.1 菌落特征的觀察

在從每種樣品分離出來的菌中找出單菌落,對其進行觀察,記錄其大小、顏色、形狀、外形等特征。

2.2.2 鏡檢

取潔凈載玻片,滴加一滴生理鹽水,在無菌條件下挑取菌體于無菌水中涂勻。待其干燥后,在酒精燈上固定,然后進行革蘭氏染色,結晶紫初染1 min→碘液媒染30 s→酒精脫色30 s→番紅復染30 s。干燥后在顯微鏡下用油鏡觀察,記錄細胞形態(tài)特征。

2.2.3 凝固試驗

取新鮮脫脂乳10 mL置于試管中,加棉塞,包扎后在0.6 MPa下滅菌20 min,冷卻至室溫。在超凈工作臺上接種,每種菌接1支試管,每支試管中接3環(huán),留1支試管不接,作空白對照,然后在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,每4 h觀察1次,并記錄其凝固情況。

2.2.4 產酸試驗

采用酸度滴定法,用吸管吸取5 mL發(fā)酵乳于100 mL的三角瓶中,加20 m L蒸餾水混勻,加入2～3滴2%酚酞指示劑,用0.1 mo L/L氫氧化鈉滴定至出現(xiàn)粉紅色,一分鐘不消失為止。

計算酸度:滴定酸度=(滴定消耗的0.1 mo L/L NaOH毫升數(shù))X 20。

2.2.5 糖發(fā)酵試驗

將配制好的糖發(fā)酵基礎培養(yǎng)基,按0.5%的比例加入糖或者醇溶液,然后裝入杜氏管中,加棉塞,包扎,0.6 MPa下滅菌20 min,冷卻至室溫。在超凈工作臺上接種,每種菌接1支,每支試管中接3環(huán)菌,留1支試管不接,作空白對照。然后在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,每4 h觀察一次,并記錄其凝固情況。若培養(yǎng)基的顏色改變,則該菌種對這種糖產酸。小套管內若有氣泡,則證明該菌種對這種糖產氣。

本次試驗使用的糖分別為:葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、棉籽糖、鼠李糖、甘露糖、果糖、半乳糖。另外還有2種醇,分別是甘露醇和山梨醇。

2.2.6 生長試驗

將配制好的培養(yǎng)基分裝入試管中,滅菌后制成斜面。將菌種分別接入試管中,每種菌接3管。完成之后,一組放在15℃下培養(yǎng),一組放在45℃條件下培養(yǎng),另外一組放在37℃條件下培養(yǎng),作為對照,24 h后觀察其生長情況。

2.2.7 耐鹽試驗

在配制好的M17培養(yǎng)基中按6.5%的比例加入NaCl固體,分裝入試管中,滅菌后制成斜面。將菌種分別接入試管中,于37℃條件下培養(yǎng)24 h,觀察菌種生長情況?？膳c生長實驗同時進行,取37℃下無鹽培養(yǎng)的菌種作為對照。

2.2.8 明膠液化試驗

將配制好的明膠培養(yǎng)基分裝至試管中,加棉塞包扎滅菌,冷卻后進行穿刺接種,每種菌接1管,留1支做空白對照。接種后的菌種置于17℃下培養(yǎng)24 h,觀察液化情況。液化的為陽性,不液化的為陰性。

2.2.9 過氧化氫酶試驗

具有過氧化氫酶的細菌,能催化過氧化氫生成水和新生態(tài)氧,從而形成分子氧出現(xiàn)氣泡。將配置好的3%的過氧化氫溶液加入到菌落上,若有氣體產生,則過氧化氫酶反應陽性,無氣體生成則為過氧化氫酶反應陰性。

3 結果與分析

實驗共得到6株菌株:蒙牛里得到3株,分別標作M1、M2、M3;花花牛里得到2株,標作H1、H2;光明里得到1株,標作G1。

3.1 形態(tài)特征的觀察

通過對菌落進行觀察,再進行革蘭氏染色后放在顯微鏡下觀察,堅持每純化一次就鏡檢一次,保證所得菌的純度。所得到的6株菌株的形態(tài)特征如表1。

由表1觀察結果可以看出,所得到的菌落都較小,表面大多比較光滑,顏色為白色或者有些泛黃。革蘭氏染色均為陽性,細胞都是圓形或者卵圓形,多個聚集生長或者連成串狀。符合《伯杰細菌鑒定手冊》中關于嗜熱鏈球菌的描述,而且酸奶中的球菌只有一種。因此初步斷定分離出的6株菌株皆為嗜熱鏈球菌[9],但還需要通過生理生化鑒定進一步確認。

表1 形態(tài)特征觀察結果

3.2 生理生化鑒定

由表2可以看出,這6株菌株都從葡萄糖、蔗糖、果糖產酸,45℃下能生長。革蘭氏染色陽性,過氧化氫酶實驗陰性,不能水解明膠,細胞都是圓形或者是卵圓形。由《伯杰細菌鑒定手冊》可以斷定它們符合嗜熱鏈球菌的特征,因此斷定它們都是嗜熱鏈球菌,并且耐鹽性和耐低溫性都比較強。

3.3 菌種的性能鑒定

將凝固試驗和產酸試驗結果進行綜合分析可以判斷所得菌株的性能。

由表3可以看出在凝固性實驗中M2凝固最快,凝固時間8 h,且凝固的結實,分布均勻,酸度也最高,達到110,是一株優(yōu)良菌株。M3和H1、H2同時凝固,凝固時間12 h,凝固得也結實,但分布不均勻,又有乳清析出,酸度都在100以上。正常酸奶的酸度在90～110吉爾涅爾度之間,酸奶中乳清的析出影響其質量,因此這3株雖然沒有M2好,但是也是不錯的菌株。M1和G1在24 h內沒有出現(xiàn)凝固現(xiàn)象,只是濃度變大,出現(xiàn)絮狀沉淀。酸度也僅在30～40吉爾涅爾度之間,太低,屬于不合格菌株。

4 討論

1 )嗜熱鏈球菌可以幫助人體消化,是人體腸道的有益菌種,也是發(fā)酵乳制品的首選菌種之一。但目前酸奶菌種價格昂貴,主要依賴國外進口,這就給酸奶制品的基礎研究、工業(yè)化生產過程及質量控制造成了一定的影響。本試驗從市場上最常見的酸奶產品:蒙牛、花花牛、光明酸牛奶中共分離出6株嗜熱鏈球菌,其中優(yōu)良菌株1株,合格菌株3株,不合格菌株2株。這樣就解決了乳制品工業(yè)(特別是實驗室基礎研究)菌種的來源問題,而且也降低了生產成本、節(jié)約了開支。下一步,可以利用本實驗分離出的優(yōu)良嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌混合發(fā)酵生產各種花色酸奶,從而滿足市場上不同消費人群的口味需求。

2 )為了更好地分離菌體,本試驗對菌液作了6種不同濃度的稀釋(10-1～10-6),結果表明,獲得良好分離效果的蒙牛樣品最適稀釋度為10-5,花花牛和光明樣品的最適稀釋度均為10-4。

3 )本試驗分離嗜熱鏈球菌采用的是改良M17培養(yǎng)基。與傳統(tǒng)的標準M17培養(yǎng)基相比,在此培養(yǎng)基上分離獲得的菌落數(shù)量多、菌落特征明顯,生長速度快。

表3 性能鑒定結果

[1]佟瀟.酸奶中嗜熱鏈球菌的分離和鑒定[J].中國乳品工業(yè),2004,32(4):25-27.

[2]彌春霞,代志平,楊蕾.酸奶中嗜熱鏈球菌的分離及鑒定[J].牡丹江師范學院學報:自然科學版,2007(3):35-36.

[3]趙鑫,趙洪雙,姜國龍.不同比例的嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌對酸奶品質的影響[J].農產品加工.學刊, 2009(3):177-180.

[4]沈萍,范秀容,李廣武.微生物學實驗[M].北京:高等教育出版社,2003:116-119.

[5]凌代文.乳酸細菌分離鑒定及實驗方法[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1999.

[6]陳芳,靳亞平.奶制品中有益菌的分離鑒定[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2007(3):102-103.

[7]陳曉平,劉華英,魏曉川.自然發(fā)酵酸菜汁中乳酸菌的分離篩選與鑒定研究[J].食品科學,2006(2):91-93.

[8]齊海萍,周鳳娟,胡文忠,等.酸乳發(fā)酵菌的分離及酸乳發(fā)酵工藝的研究[J].中國釀造,2006(3):31-34.

[9]布坎南.伯杰氏細菌鑒定手冊[M].北京:科學技術出版社,1984.