余允清，田素英＊，梅全喜

（1.廣東藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.中山市中醫(yī)院，廣東 中山 528401）

廣東土牛膝為菊科植物華澤蘭（Eupatorium Chinense Linn.）的干燥根及根莖，性寒，味甘、苦，具有清熱解毒、涼血利咽、抗炎鎮(zhèn)痛等功效，臨床上用于治療白喉、蛾喉、咽喉紅腫等癥，有喉科圣藥之稱，民間應(yīng)用廣泛［1］?，F(xiàn)代藥理研究表明，廣東土牛膝具有抗菌、中和毒素和抗炎鎮(zhèn)痛作用［2－3］。目前，以廣東土牛膝為主藥的復(fù)方土牛膝制劑在珠三角地區(qū)各級(jí)醫(yī)院普遍使用，如復(fù)方土牛膝合劑、復(fù)方土牛膝顆粒、復(fù)方土牛膝糖漿等［4］。隨著對(duì)廣東土牛膝需求不斷增加，其野生資源面臨枯竭。故本試驗(yàn)對(duì)廣東土牛膝葉片和莖段組織培養(yǎng)進(jìn)行研究，以選擇最佳組織培養(yǎng)條件來滿足規(guī)?；a(chǎn)。

1 材料與儀器

恒溫恒濕箱（SPX－250C型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），潔凈工作臺(tái)（SW－CT－1FD，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX－50FAS）。廣東土牛膝植株（經(jīng)田素英副教授鑒定為菊科植物華澤蘭（Eupatorium Chinense Linn.）。取廣東土牛膝幼嫩葉及莖段，用吐溫－80清洗1次，用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水清洗兩遍，吸干水分，用70%酒精浸泡10s，再用0.1%升汞浸泡10min，然后用無菌水沖洗5～6次，剪切成小塊或適合的大小，置于無菌濾紙上吸干水分后，作為外植體備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基配制

母液1：取33gNH4NO3、38gKNO3、7.4gMgSO4·7H20，20倍水溶解定容至1000mL；母液2：取22.0gCaCl2，100倍水溶解定容至500mL；母液3：取8.5gKH2PO4，用100倍水溶解定容至500mL；母液4：取3.73gNa2EDTA、2.78gFeSO4·7H20，100倍水溶解定容至500mL；母液5：取3.1gH2BO3、4.3gZnSO4·7H20、11.15gMnSO4·4H20、0.415gKI、0.125gNa2MoO4·2H20、0.0125gCuSO4·5H20、0.0125g CoCl2·6H20，1000倍水溶解定容至500mL；母液6：取5000mg肌醇、100mg甘氨酸、25mg煙酸、5mg鹽酸硫胺素（B1）、25mg鹽酸吡哆醇（B6），50倍水溶解定容至500mL。上述母液按1、3、2、5、4、6的順序分別吸取用量50mL、10mL、10mL、1mL、10mL、10mL加入到1000mL燒杯中，加入7g·L－1的瓊脂和30g·L－1的蔗糖，加水至500mL，使蔗糖溶解，加熱至沸騰，調(diào)節(jié)pH（5.8～6.2），并加入一定濃度的IBA和6－BA，分別裝入培養(yǎng)瓶中，每瓶50mL，標(biāo)記培養(yǎng)基成分。在壓力0.1MPa，121.5℃下滅菌20min。將取出的滅菌培養(yǎng)基在室溫下放置24h，經(jīng)檢查沒有雜菌生長(zhǎng)，備用。

2.2 外植體篩選

先以 MS＋6－BA2.0mg·L－1＋I(xiàn)BA0.1mg·L－1＋30g·L－1蔗糖＋7g·L－1瓊脂為培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)初試驗(yàn)。外植體材料包括葉片、節(jié)間、未長(zhǎng)芽莖段、帶芽莖段（芽長(zhǎng)2mm以下）和帶芽莖段（芽長(zhǎng)2mm以上），每種材料接種50瓶，每瓶接種3個(gè)外植體，置于25℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)7d，待葉片愈傷組織或莖段腋芽出現(xiàn)生長(zhǎng)現(xiàn)象時(shí)轉(zhuǎn)為光照8～10h／d。從結(jié)果可知所選用培養(yǎng)基可誘導(dǎo)廣東土牛膝葉片生成愈傷組織，對(duì)節(jié)間培養(yǎng)無明顯現(xiàn)象，對(duì)所選的未長(zhǎng)芽莖段、帶芽莖段（2mm以下，含2mm）和帶芽莖段（2mm以上）組織培養(yǎng)不定芽誘導(dǎo)率有明顯差異，未長(zhǎng)芽莖段生長(zhǎng)速度較慢，且不定芽數(shù)較少，帶芽莖段（2mm以下，含2mm）不定芽誘導(dǎo)率最高，且生長(zhǎng)能力強(qiáng)，不定芽數(shù)較多，不定芽較粗壯，生長(zhǎng)能力強(qiáng)，有繼續(xù)分生的趨勢(shì)，帶芽莖段（2mm以上）的分生能力強(qiáng)，生長(zhǎng)速度最快，不定芽較長(zhǎng)，但較前者細(xì)，且污染率為三者中最高，因此，帶芽莖段（2mm以下，含2mm）為最適合的莖段培養(yǎng)部位。故選廣東土牛膝葉片與帶芽莖段（2mm以下，含2mm）為外植體。

2.3 誘導(dǎo)葉片愈傷組織培養(yǎng)基篩選

以MS為基本培養(yǎng)基，每升加入蔗糖30g和瓊脂7g，分別添加1.0、2.0、3.0mg·L－16－BA 與0.1、0.2mg·L－1IBA，組成6種培養(yǎng)基，每個(gè)組合接種50瓶，每瓶3個(gè)外植體，置于25℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)7d，待葉片愈傷組織或莖段腋芽出現(xiàn)生長(zhǎng)現(xiàn)象時(shí)轉(zhuǎn)為光照8～10h／d培養(yǎng)。結(jié)果在葉片愈傷組織生成中，誘導(dǎo)率最高的培養(yǎng)基是6－BA（2.0mg·L－1）＋I(xiàn)BA（0.1mg·L－1），誘導(dǎo)率達(dá)到92.31%，誘導(dǎo)率最低的培養(yǎng)基是6－BA（1.0mg·L－1）＋I(xiàn)BA（0.2mg·L－1），誘導(dǎo)率僅為8.33%。且愈傷組織的生長(zhǎng)情況與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素的濃度、比例有關(guān)。6－BA／IBA比例在20左右比較適合廣東土牛膝葉片愈傷組織的誘導(dǎo)。

2.4 誘導(dǎo)不定芽培養(yǎng)基篩選

采用“2.3”項(xiàng)下葉片愈傷組織誘導(dǎo)所用的6種培養(yǎng)基和篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行誘導(dǎo)試驗(yàn)，在誘導(dǎo)不定芽生長(zhǎng)試驗(yàn)中，誘導(dǎo)率最高的培養(yǎng)基同樣是6－BA（2.0mg·L－1）＋I(xiàn)BA（0.1mg·L－1），誘導(dǎo)率達(dá)到94.96%，誘導(dǎo)率最低的培養(yǎng)基是6－BA（1.0mg·L－1）＋I(xiàn)BA（0.2mg·L－1），誘導(dǎo)率僅為7.63%。且不定芽的誘導(dǎo)率與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素的濃度、比例也有關(guān)。在IBA低濃度比例培養(yǎng)基中，莖段直接生成芽的頻率較高；而在IBA濃度比例較高時(shí)，莖段有形成愈傷組織的趨勢(shì)。根據(jù)外植體的不定芽誘導(dǎo)率及其生長(zhǎng)情況，可認(rèn)為廣東土牛膝莖段誘導(dǎo)直接生成芽最適宜的6－BA與IBA濃度分別為2.0mg·L－1和0.1mg·L－1。

2.5 發(fā)芽實(shí)驗(yàn)

采用“2.3”項(xiàng)下葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)所用的6種培養(yǎng)基，分別將“2.3”項(xiàng)形成的愈傷組織、“2.4”項(xiàng)形成的不定芽接種于培養(yǎng)基，置于25℃培養(yǎng)箱中光照8～10h／d培養(yǎng)。結(jié)果在培養(yǎng)基 MS＋6－BA（2.0mg·L－1）＋I(xiàn)BA（0.1mg·L－1）＋蔗糖（30g·L－1）＋瓊脂（7g·L－1）培養(yǎng)下，愈傷組織保持增殖生長(zhǎng)，但無生成不定芽跡象，說明此培養(yǎng)基可用于廣東土牛膝愈傷組織的增殖，但不適合用于誘導(dǎo)愈傷生成芽。在0.1mg·L－1IBA和2.0mg·L－16－BA組合的培養(yǎng)基中，不定芽有明顯增殖或長(zhǎng)高的趨勢(shì)。

2.6 生根試驗(yàn)

以1／2MS為基本培養(yǎng)基，每升加入蔗糖30g和瓊脂7g，添加1.0～3.0mg·L－1梯度的IBA，組成3種培養(yǎng)基，每個(gè)組合接種約50瓶，每瓶接1個(gè)不定芽，培養(yǎng)30d。生長(zhǎng)素IBA濃度為1.0～2.0mg·L－1時(shí)，生根效果不明顯，生根率較低，且根較短；濃度為3.0mg·L－1時(shí)，生根率、根長(zhǎng)度達(dá)到移栽的要求。

3 討論

本試驗(yàn)用IBA與6－BA搭配MS培養(yǎng)基使用，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)溫度為25℃時(shí)，2.0mg·L－16－BA與0.1mg·L－1IBA能導(dǎo)致廣東土牛膝生成愈傷組織，且生成的愈傷組織顆粒大、發(fā)生早。帶芽莖段（腋芽2mm以下）在同樣的培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度下可誘導(dǎo)生成不定芽、誘導(dǎo)不定芽增殖。1.0～2.0mg·L－1的IBA對(duì)不定芽誘導(dǎo)生根結(jié)果不理想。莖段培養(yǎng)應(yīng)在培養(yǎng)期的前7d進(jìn)行避光培養(yǎng)，待長(zhǎng)出不定芽后進(jìn)行8～10h／d光照培養(yǎng)。廣東土牛膝組織培養(yǎng)試驗(yàn)中，污染率較高。在材料表面、材料附近的培養(yǎng)基以及培養(yǎng)基的其它部位，表現(xiàn)為霉變或混濁或云霧狀、粘液狀、發(fā)酵泡沫狀等不同形狀、顏色和大小的污染痕跡。污染有可能是外植體帶菌引起的，也有可能是接種或培養(yǎng)過程中染菌引起的，既有在當(dāng)代培養(yǎng)期間就表現(xiàn)出來的，也有在材料培養(yǎng)到一定代數(shù)才表現(xiàn)出來的。因此，在試驗(yàn)中應(yīng)對(duì)外植體進(jìn)行徹底清洗和消毒，接種過程應(yīng)嚴(yán)格按照無菌操作進(jìn)行。其次，接種后部分外植體出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，這與接種溫度、光照條件、生長(zhǎng)素濃度以及外植體分泌液有關(guān)，因此本實(shí)驗(yàn)針對(duì)不同的褐變現(xiàn)象對(duì)培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件進(jìn)行調(diào)節(jié)，同時(shí)在培養(yǎng)基中添加適量的炭粉，以減少褐變。

［1］趙思兢.土牛膝生態(tài)及治療喉癥的文獻(xiàn)檢索［J］.廣東中醫(yī)，1958，3（7）：28.

［2］曾品會(huì).土牛膝根對(duì)白喉?xiàng)U菌的抑制和對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的觀察［J］.廣東中醫(yī)，1959，4（9）：45－347.

［3］陳國(guó)清，邱小梅，鄭鳴金，等.14種草藥對(duì)白喉菌的抗生力中及其對(duì)白喉毒素作用的觀察［J］.福建中醫(yī)藥，1964（9）：137－147.

［4］田素英，梅全喜.廣東土牛膝復(fù)方制劑的研究進(jìn)展［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，11（17）：2175－2176.