高 峰，陳世玖，張麗杰，倪少俊，楊 軍，李 智

(遵義醫(yī)學院第五附屬(珠海)醫(yī)院手外、整形科，廣東珠海519100)

指甲再生來源于甲根和甲弧影下方的甲床，此處的甲床稱為甲母質。甲床提供指甲向遠端生長的滑面，當甲床受損后，新生的指甲會出現(xiàn)不整齊現(xiàn)象而影響美觀。因此，臨床工作者們不懈地努力研究，不同類型的甲床損傷采用何種方式修復，術后能達到理想的效果。隨著顯微技術的發(fā)展，可根據(jù)情況選擇不同的方法，完善了甲床損傷的治療，如游離甲床移植術、皮瓣修復術、游離甲瓣修復術等。近些年，對甲床基礎的研究相對較少，本實驗旨在為深入研究甲床細胞奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 甲床上皮細胞組織塊

培養(yǎng) 收集一名臨床志愿者因經?？漆t(yī)師檢查及超聲波檢查后發(fā)現(xiàn)胎兒死在宮內，進行立即引產，取得胎兒手指(經本人和家屬知情同意)。將20周以上胎兒手指放入70%乙醇中浸泡5 min，取出后用磷酸鹽緩沖液沖洗3遍。超凈工作臺內4倍手術放大鏡下，切取甲床，放入含雙抗的磷酸鹽緩沖液中備用。將切取的甲床組織在培養(yǎng)皿內用眼科剪將其剪切成1 mm2的小塊，均勻地平鋪于25 cm2培養(yǎng)瓶底部，組織塊與組織塊之間保持0.5 cm左右的距離，加入無血清角化細胞培養(yǎng)基，于37℃ CO2培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～4 h，待組織塊黏著牢固時，加入0.001～0.002 L培養(yǎng)液，然后翻轉培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液慢慢浸潤組織塊，再輕輕且緩慢翻轉正置培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)基剛好浸過組織塊平面，以不令組織塊漂起為標準。再于37℃ CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24～48 h后補加培養(yǎng)液0.002～0.003 L，培養(yǎng)的前2 d應避免過多觀察和晃動培養(yǎng)瓶，以防組織塊脫壁。以后每天觀察組織塊的變化，21 d仍無細胞生長者予以淘汰。

1.2 甲床成纖維細胞組織塊培養(yǎng) 收集、獲得組織塊及培養(yǎng)方法同1.1段所述。采用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基。

1.3 細胞鑒定 甲床上皮細胞檢測角蛋白17，免疫組織化學染色法，按試劑盒操作說明進行。成纖維細胞免疫熒光顯微鏡檢測波形蛋白表達方法按公司產品說明書并按參考文獻［1］進行。

2 結果

2.1 甲床細胞生長情況

2.1.1 甲床上皮細胞 倒置顯微鏡觀察，2～3 d左右從組織塊中游出，并在組織塊周圍形成生長暈，能游出細胞的組織塊占貼附組織塊的比例約1/3，13 d左右細胞生長密度可達瓶底的70%～80%，扁圓形或多角形細胞，呈鋪路石樣排列，其數(shù)目可達1×1010～1 ×1011個/L。

2.1.2 甲床成纖維細胞 2 d可見組織塊周圍有的細胞游離出來，呈放射狀，3 d觀察可見組織塊周圍有許多生長的細胞，呈圓梭形、長梭形、多角形等成纖維細胞的特征，胞體豐富，胞質均勻，細胞核清晰可見，11 d左右細胞生長密度可達瓶底的70%～80%。其數(shù)目可達1×1010～1×1011個/L。

2.2 甲床細胞的免疫細胞化學鑒定 培養(yǎng)的甲床上皮細胞70%以上特異性角蛋白17抗體染色陽性，證明培養(yǎng)的細胞為甲床上皮細胞;培養(yǎng)的甲床成纖維細胞抗波形蛋白抗體染色陽性，說明培養(yǎng)的細胞為成纖維細胞。

3 討論

指(趾)甲和甲床作為皮膚的附屬組織，具有與皮膚不同的組織結構，并由此具有特殊的功能，如對指功能和美容作用等。指(趾)甲由外胚層分化而來。第13周時，發(fā)育中的甲單位的上皮能夠分成四層:基底層、棘細胞層、顆粒層和角質層，被稱為甲床上皮。在20周時甲板完全覆蓋甲床，并且甲床上皮完全失去顆粒層，此時，胎兒的甲與成人的甲基本相似。所以，本研究選擇此時期胎兒甲床作為標本。甲床兩種主要功能細胞，分別為上皮細胞和成纖維細胞，它對甲床的再生及形態(tài)的維持，起重要作用。

原代細胞的獲取，有組織塊培養(yǎng)法及消化法兩種。由于大多數(shù)情況下難以獲得大量的甲床標本，可以根據(jù)標本的大小來決定培養(yǎng)方法［2］。如果獲得的標本較大，應用胰酶消化法;在獲得的標本較小的情況下，則應用組織塊法培養(yǎng)。甲床上皮細胞屬于角化細胞，貼壁生長相對困難，為了促進角化細胞貼壁，不同學者采用過不同的方法。Nagae等［2］應用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)甲床細胞成功，證明角化細胞培養(yǎng)液是甲床細胞的良好培養(yǎng)基。劉東昕等［3］采用胰酶消化法及應用無血清角化細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)甲床上皮細胞，獲得成功。De Berker等［4］證實了甲基質部位上皮細胞增殖旺盛，是甲板的主要來源。

細胞角蛋白只在上皮細胞或外胚層起源的細胞中表達，在不同細胞中有不同亞型表達［5］。角蛋白是上皮細胞主要的結構蛋白和分化的標志產物。角蛋白分為兩大類，即皮膚型角蛋白和毛發(fā)角蛋白。皮膚型角蛋白主要表達于皮膚等部位，毛發(fā)型角蛋白主要表達于毛發(fā)、指甲等部位。Berker等［6］的實驗表明，在甲床的上皮細胞中表達K17蛋白?？筀17免疫組織化學染色，證實甲床上皮細胞，同時也說明甲床上皮細胞在體外培養(yǎng)條件下，蛋白的表達沒有明顯改變。劉東昕等［3］也通過實驗研究應用抗K17免疫組織化學染色，證實甲床上皮細胞。

本實驗應用組織塊培養(yǎng)法成功地培養(yǎng)出甲床上皮細胞及甲床成纖維細胞，也證實了甲床上皮細胞在無血清角化細胞培養(yǎng)液中生長良好。雖與酶消化法相比，獲取細胞時間上相多較長，但組織塊法為傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)方法，容易操作，成功率高。而酶消化法的濃度及消化時間難以掌握，不易獲取，實驗成功率低。組織塊培養(yǎng)時應注意以下幾點:①實驗材料要新鮮，從活體分離材料后要低溫保存，并盡快進行細胞分離實驗;②遵守細胞培養(yǎng)的無菌操作;③分離細胞時，注意動作要輕柔，不要傷到細胞組織，組織塊邊緣盡量平整有利于細胞游離;④培養(yǎng)過程中避免組織塊干燥脫水;⑤2 d內避免過多觀察和晃動培養(yǎng)瓶，以防組織塊脫壁。

甲床缺損是常見的手外傷類型，隨著顯微外科的發(fā)展，臨床工作者在不斷尋求甲床修復的最佳方法。雖然現(xiàn)在甲床修復方式較多，仍存較多缺點，如游離指(趾)甲床移植再造手指甲床，成活后指甲形態(tài)較美觀，卻會失去另一個相對次要的指(趾)甲;游離甲瓣修復術，可使傷指再生指甲、恢復手指感覺，卻需要一個足趾付出較大的代價。所以不管采用何種修復方法，均存在一定弊端。如果體外構建組織工程甲床成功，將會避免以損害其他組織為代價。本研究體外培養(yǎng)甲床細胞成功，為進一步構建組織工程甲床奠定了基礎。

［1］ Aicher A，Heeschen C，Mohanpt M，et al.Nicotine strongly activatesdendritic cell-mediated adaptive immunity-potential role for progressionof atherosclerotic lesions［J］.Circulation，2003，107 (4):604-611.

［2］ Nagae H，Nakanishi H，Urano Y，et al.Serial cultivation of human nail matrix cells under serum-free conditions［J］.J Dermatol，1995，22(8):500-566.

［3］ 劉東昕，路來金，王虎.胰酶分次消化及無血清角化細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)甲床上皮細胞的體外實驗［J］.中國臨床康復，2006，10 (5):40-41.

［4］ De Berker D，Angus B.Proliferative compartments in the normal nail unit［J］.Br J Dermatol，1996，135(4):555-559.

［5］ Carmona FD，Ou J，Jiménez R，et al.Development of the cornea of truemoles morphogenesis and expressionof PAX6 and cytokeratins［J］.J Anatomy，2010，217(5):488-500.

［6］ De Berker D，Wojnarowska F，Sviland L，et al.Keratin expression in the normalnail unit:markers of regional differentiation［J］.Br J Dermatol，2000，142(1):89-96.