胡 衛(wèi)，王 泉，方肇勤

（1.三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2上海中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203）

肝癌是我國(guó)最為常見的惡性腫瘤之一，我國(guó)的肝癌患者約占全球總患者數(shù)的55%，其相關(guān)死亡率排名第二，僅次于肺癌［1］。迄今為止針對(duì)肝癌的治療缺乏行之有效的方法，應(yīng)用最多的手術(shù)切除肝癌，其5年的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率十分高，死亡率也居高不下［2］。肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有一系列基因參與調(diào)控，它涉及到細(xì)胞基因改變、侵襲力、黏附能力、產(chǎn)生局部血凝因子或血管生成的能力、分泌代謝功能以及腫瘤細(xì)胞與宿主、腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)之間相互關(guān)系的多步驟、多因素參與的過(guò)程［3］。RNA 干擾（RNAi）是由雙鏈 RNA（double－stranded RNA，dsRNA）引起的廣泛存在于動(dòng)植物中的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默，從而抑制其相應(yīng)基因表達(dá)的過(guò)程。近年RNAi已被認(rèn)為是真核生物基因表達(dá)的主要調(diào)節(jié)機(jī)制，由于其具有高效性、高特異性和高穩(wěn)定性等特點(diǎn)，已成為基因功能研究的有力工具，廣泛應(yīng)用于闡述包括腫瘤在內(nèi)的各種疾病的分子機(jī)制，為可能的基因治療和藥物治療提供依據(jù)。近年來(lái)在肝癌研究中，通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制相關(guān)基因表達(dá)后，再檢測(cè)細(xì)胞侵襲、遷移能力或者實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，揭示了肝癌發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的分子機(jī)理。

1 肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的分子機(jī)制

肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)涉及細(xì)胞粘附、運(yùn)動(dòng)、增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的降解、機(jī)體免疫與腫瘤血管生成等環(huán)節(jié)，其分子機(jī)制主要有：與侵襲相關(guān)的抑癌基因的失活和癌基因的表達(dá)增加、與轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有關(guān)的細(xì)胞因子及其受體表達(dá)水平的變化、基質(zhì)金屬蛋白酶異常表達(dá)、腫瘤微血管密度的影響等。

2 肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)基因的RNAi

現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一大批與肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，如H－ras基因、Bmi－1基因、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）基因、p53基因等。

2.1 H－ras基因

H－ras基因定位于11p15.5，由于它編碼的蛋白質(zhì)分子量為21kb，又被稱為p21分子。在原發(fā)性肝癌中，H－ras癌基因mRNA及蛋白質(zhì)水平均有明顯升高。Wang等［4］應(yīng)用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將H－ras基因?qū)肴烁伟┘?xì)胞株SMMC－7721，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染H－ras的細(xì)胞粘附能力提高、運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)及cⅣase、EGFR表達(dá)增加，且上述變化與p21的表達(dá)顯著相關(guān)，表明H－ras癌基因能在體外誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移表型的產(chǎn)生，提高肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。由于突變的H－ras基因與正常的H－ras基因堿基序列不同，利用RNAi的特異性可對(duì)突變的H－ras基因進(jìn)行針對(duì)性抑制。有學(xué)者將H1啟動(dòng)子嵌入到MSCV病毒載體中組成siRNA載體，成功地抑制了ras基因的表達(dá)［5］。

2.2 CXCR4

趨化因子受體CXCR4（chemokine receptor4，CXCR4）是組織表達(dá)最為廣泛的趨化因子受體之一，在肝癌中的高表達(dá)與其細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移中都有很重要的作用［6］。夏斌等［7］將構(gòu)建的靶向CXCR4的siRNA真核表達(dá)載體通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入人肝癌細(xì)胞SMMC7721后，發(fā)現(xiàn)干擾組能明顯抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

2.3 Rho－C基因

Rho－C（Ras homologous C）基因是 Rho家族的一個(gè)成員，參與細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)、增殖和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)，在多種腫瘤尤其是轉(zhuǎn)移侵襲性強(qiáng)的腫瘤中表達(dá)增高［8］。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)Rho－C與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移表型的獲得有密切關(guān)系［9］。有研究［10］用 Rho－C－siRNA 真核表達(dá) 載體轉(zhuǎn)染SK2－Hep1肝癌細(xì)胞后，細(xì)胞中Rho－C蛋白表達(dá)水平降低達(dá)60%，細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)能力及體外侵襲能力均降低。ZHENG等［11］用Rho－C基因的RNA干擾載體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞Bel7402，以沉默Rho－C基因表達(dá)，結(jié)果顯示Rho－C基因沉默能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞Bel7402凋亡并抑制細(xì)胞遷移和非錨定生長(zhǎng)能力。

2.4 OPN基因

骨橋蛋白（osteopontin，OPN）基因定位在人類基因組的4q13，它與腫瘤及原癌基因的調(diào)控密切相關(guān)。OPN含有與細(xì)胞粘附有關(guān)的精氨酸－谷氨酸－天冬氨酸（RGD）序列，并通過(guò)受體CD44、整合素等來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的趨化、粘附和遷移。Ye等［12］報(bào)道OPN在轉(zhuǎn)移性、高侵襲性的肝癌中過(guò)表達(dá)。在試驗(yàn)中敲除掉OPN特異性抗體的細(xì)胞，無(wú)論在實(shí)驗(yàn)室還是植入裸鼠后，很快發(fā)生了轉(zhuǎn)移。溫敏杰等［13］的研究也證實(shí)了RNA干擾降低OPN的表達(dá)后，肝癌裸鼠移植瘤的體積和質(zhì)量明顯縮小。

2.5 HMGA1

HMGA1（High mobility group A1，高遷移率族蛋白A1）是位于細(xì)胞核內(nèi)的小分子非組蛋白，參與細(xì)胞多種重要生物學(xué)過(guò)程。HMGA1在胚胎期表達(dá)豐富，而在成熟組織中則表達(dá)極少或缺失。在病理情況下，相當(dāng)多的惡性腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)有HMGA1的高水平表達(dá)，并且其表達(dá)量與腫瘤惡性程度及轉(zhuǎn)移能力成正相關(guān)［14，15］。朱明光等［16］成功建立了基因沉默HMGA1穩(wěn)定細(xì)胞株；HMGA1基因沉默后，細(xì)胞增殖與質(zhì)粒對(duì)照組和空白對(duì)照組相比顯著降低，細(xì)胞凋亡百分率明顯升高。

2.6 c－Met

原癌基因c－met編碼的跨膜蛋白c－Met是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）的單一受體。大量的證據(jù)表明，HGF／c－Met信號(hào)通路異常在人類各種腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用，該通路的內(nèi)源及外源抑制劑引起了人們的廣泛關(guān)注。謝斌等［17］探討了c－Met－siRNA對(duì)肝細(xì)胞癌生長(zhǎng)和侵襲的影響，將構(gòu)建好的c－Met－siRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒感染靶細(xì)胞 MHCC97－H后發(fā)現(xiàn)，目的基因的表達(dá)量顯著降低，且細(xì)胞的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)及侵襲均受到明顯抑制。

2.7 CDC25B

CDC25B（cell division cycle 25B）是CDC25激酶家族的最重要成員，貫穿細(xì)胞周期的各階段，其在細(xì)胞周期各期轉(zhuǎn)換中起關(guān)鍵作用，在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中發(fā)揮重要作用。過(guò)量CDC25B可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。Xin等［18］通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和免疫組化染色方法證實(shí)CDC25B在肝癌組織表達(dá)明顯高于正常肝臟組織，并將針對(duì)CDC25B基因的siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株Hep3B和Hep40后，顯著抑制CDC25B基因表達(dá)（90%），同時(shí)明顯抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)和侵襲能力，將細(xì)胞阻滯在G2期，在接種Hep40的裸鼠身上也發(fā)現(xiàn)其能明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

2.8 Bmi－1

原癌基因 Bmi－1（B cell－specific moloney murine leukeria virus insertion site－1）是多梳基因家族（polycomb group genes，PcG）的成員之一，在細(xì)胞的增殖和干細(xì)胞自我更新、分化調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［19，20］。目前，已有多項(xiàng)研究報(bào)道Bmi－1在多種腫瘤如白血病、乳腺癌、肺癌、胃癌等中高表達(dá)，并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散相關(guān)［21］。李小磊等［22］將針對(duì)Bmi－1基因序列特異性的Bmi－1－siRNA轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞株MHCC97－H，發(fā)現(xiàn)沉默Bmi－1基因表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞株MHCC97－H的侵襲遷移力。

2.9 P53

野生型P53是一種抑癌基因，與細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生關(guān)系密切［23］。在同時(shí)表達(dá)野生型P53和點(diǎn)突變P53的細(xì)胞中，RNA序列能特異地抑制突變型P53的表達(dá)，并在一定程度上恢復(fù)野生型基因P53的表達(dá)和功能［24］。有人［25］將外源性 P53dsRNA 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肝癌 SK－Hep－l細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)P53dsRNA可明顯抑制P53和部分抑制P21蛋白的表達(dá)，并明顯促進(jìn)SK－Hep－1細(xì)胞的增殖。

2.10 ICAM－1

血清可溶性細(xì)胞間粘附分子－1（Serum Intercellular Adhesion Molecule－1，sICAM－1）屬于免疫球蛋白超家族成員，它不僅參與免疫效應(yīng)細(xì)胞識(shí)別，而且在多種腫瘤細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。廖維甲等［26］成功構(gòu)建了針對(duì)該基因的pGenesil－1／ICAM－1表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株Bel－7402和HepG2，并通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肝癌細(xì)胞中ICAM－1基因表達(dá)抑制情況。結(jié)果表明經(jīng)特異性siRNA作用后肝癌細(xì)胞中ICAM－1基因的表達(dá)受到抑制，同時(shí)細(xì)胞增殖受到抑制。

2.11 Hpa

Hpa（heparanase，肝素酶）是一種β－D－葡萄糖苷酸內(nèi)切酶，在腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管形成過(guò)程中起重要作用。檀英霞等［27］將脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將構(gòu)建的2個(gè)Hpa－shRNA真核表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HepG2（高表達(dá)Hpa），將干擾組和對(duì)照組的腫瘤細(xì)胞接種到裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)干擾后的HepG2細(xì)胞中Hpa mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)明顯降低，干擾組裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯變慢。

2.12 VEGF

VEGF（vascular endothelial growth factor，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）具有強(qiáng)大的刺激血管生成能力，可增加微血管的通透性，刺激內(nèi)皮細(xì)胞分裂以及增加組織因子和一些蛋白酶的產(chǎn)生，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中起促進(jìn)作用。蔣冬貴等［28］將自主構(gòu)建的pcDUVEGF－1和pcDUVEGF－2以及體外合成的 TWvegf－1和 TWvegf－2siRNA片段轉(zhuǎn)染肝癌Hep－3B細(xì)胞，檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后VEGF的 mRNA及蛋白表達(dá)水平，結(jié)果兩種RNA干擾的方法均能顯著抑制VEGF基因mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)。

2.13 ezrin

骨架蛋白的重排是引起細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增加，腫瘤早期轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。ezrin（膜－細(xì)胞骨架聯(lián)接蛋白）作為ERM蛋白家族的成員，是一種胞膜與細(xì)胞骨架的聯(lián)接蛋白。張巖等［29］先檢測(cè)ezrin和骨架蛋白在不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)，再選取高轉(zhuǎn)移潛能SF7721和MHCC97－H細(xì)胞系為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)RNA干擾可下調(diào)這兩個(gè)細(xì)胞系中ezrin蛋白的表達(dá)，并且使其增殖和侵襲能力均顯著下降。

3 展望

RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及其分子生物學(xué)機(jī)制和功能的初步闡明，為成功地應(yīng)用RNAi從基因水平研究肝癌提供了理論基礎(chǔ)，為肝癌的靶向治療奠定了基礎(chǔ)。隨著RNAi技術(shù)的迅速發(fā)展。有關(guān)肝癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的多基因、多位點(diǎn)研究取得了豐碩成果，充分顯示了RNAi在肝癌研究中的巨大潛力和廣闊的應(yīng)用前景。RNAi研究肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)功能，少見系統(tǒng)深入的研究報(bào)道，都是針對(duì)某個(gè)與腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，構(gòu)建載體研究其表達(dá)下調(diào)后對(duì)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，均沒(méi)有進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。此外，目前對(duì)RNAi沉默目的基因后基因功能的檢測(cè)，沒(méi)有形成一套容易操作且能明確體現(xiàn)目的基因的主要生物學(xué)功能標(biāo)準(zhǔn)，這也是現(xiàn)階段RNAi應(yīng)用于腫瘤相關(guān)基因功能研究的一個(gè)重要問(wèn)題；而且目前針對(duì)單基因的研究較多，而RNAi應(yīng)用于系統(tǒng)研究多基因功能的報(bào)道較少見，而肝癌的發(fā)生是多因素、多基因共同作用的結(jié)果，開展多基因功能篩選、以細(xì)胞通路為研究對(duì)象是以后的發(fā)展趨勢(shì)。

［1］楊秉輝，叢文銘，周曉軍，等.原發(fā)性肝癌規(guī)范化診治專家共識(shí)［J］.臨床腫瘤學(xué)雜志，2009，14（3）：259－269.

［2］邱謝武，于聰慧.肝癌干細(xì)胞與肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展［J］.世界華人消化雜志，2011，19（17）：1802－1807.

［3］李立祥，熊奇如.肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相關(guān)影響因素研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2007（15）：1869－1873.

［4］WANG Q，LIN ZY，F(xiàn)ENG XL，et al.Alterations in metastatic properties of hepatocellular carcinoma cell following H－ras oncogene transfection［J］.World J Gastroenterol，2001（7）：335－339.

［5］BRUMMEKAMP TR，BERNARDS R，AGAMI R.Stable suppression of tumorigenieity by virus－mediated RNA interference［J］.Cancer Cell，2002，2（3）：243－247.

［6］LI N，GUO W，SHI J，et al.Expression of the chemokine receptor CXCR4in human hepatocellular carcinoma and its role in portal vein tumor thrombus［J］.Journal of Experimental ＆ Clinical Cancer Research，2010（29）：156－163.

［7］夏斌，雷振宇，夏文豪.CXCR4基因RNA干擾對(duì)人肝癌細(xì)胞系SMMC7721體外粘附、遷移的影響［J］.咸寧學(xué)院學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2010，24（2）：108－110.

［8］WANG W，YANG L Y，YANG ZL，et al.Elevated expression of autocrine motility factor receptor correlates with overexpression of RhoC and indicates poor prognosis in hepatocellular carcinoma［J］.Dig Dis Sci，2007，52（3）：770－775.

［9］PAN Q ，BAOL W，TEKNOS T N，et al.Targeted disruption of protein kinase Cepsilon reduces cell invasion and motility through inactivation of RhoA and RhoC GTPases in head and neck squamous cell carcinoma［J］.Cancer Res.2006，66（19）：9379－9384.

［10］XIE SHU LI，CHEN ZHI MING，SU XUE JIN，et al.Inhibition of Hepatocellular Carcinoma Cell Proliferation by RhoC Gene Silencing with RNAi［J］.Chin J Biologicals，2008，21（5）：354－366.

［11］ZHENG WENJIAN，LIANG PING，ZHAO HONG ZHI.Role of RhoC siRNA expression vector on growth velocity and invasiveness of hepatomacarcinoma cells［J］.Acta Academiae Medicinae Militaris Tertiae，2008，29 （18）：1779－1782.

［12］YE QH，QIN LX，F(xiàn)ORGUES M，et al.Predicting hepatitis B virus－positive metastatic hepatocellular carcinomas using gene expression profiling and supervised machine learning［J］.Nat Med，2003（9）：416－423.

［13］溫敏杰，朱光輝，蔡文松，等.靶向骨橋蛋白基因的RNA干擾對(duì)裸鼠肝癌影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2008，7（2）：1－2.

［14］FUSCO AM，F(xiàn)EDELE M.Roles of HMGA proteins in cancer［J］.Nat Rev Cancer，2007，7（12）：899－910.

［15］CHANG ZG，YANG LY，WANG W，et al.Determination of high mobility group A1（HMGA1）expression in hepatocellular carcinoma：apotential prognostic marker［J］.Dig Dis Sci，2005，50（10）：1764－1770.

［16］朱明光，張?chǎng)危t艷，等.RNAi沉默HMGA1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2007，23（7）：634－636.

［17］謝斌，唐德國(guó)，董家鴻.C－met－siRNA在肝癌細(xì)胞株 MHCC97－H侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用［J］.中華肝臟病雜志，2006，14（7）：499－502.

［18］XINRUI YAN，MEI－SZE CHUA，JING HE，et al.Small interfering RNA targeting CDC25Binhibits liver tumor growth in vitro and in vivo［J］.Molecular Cancer，2008（7）：19－27.

［19］ROSSI DJ，JAMIESON CH，WEISSMAN IL.Stem cells and the pathways to aging and cancer［J］.Cell，2008，132（4）：681－696.

［20］HONIG A，WEIDLER C，HAUSLER S，et al.Overexpression of polycomb protein BMI－1in humane specimens of breast，ovarian ，endometrial and cervical cancer［J］.Anticancer Res，2010，30（5）：1559－1564.

［21］LIU JH，SONG LB，ZHANG X，et al.Bmi－1expression predicts prognosis for patients with gastric carcinoma［J］.J S Oncol，2008，97（3），267－272.

［22］李小磊，宋文杰，陳 戰(zhàn)，等.siRNA沉默Bmi－1基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞株MHCC97－H侵襲遷移能力的影響［J］.世界華人消化雜志，2011，19（36）：3643－3648.

［23］STAIB F，HUSSAIN SP，HOFSETH LJ，et al.TP53and liver carcinogenesis［J］Hum Mut，2003，21（3）：201－216.

［24］MARTINEZ LA，NAGUIBNEVA I，LEHRMANN H，et al.Synthetic small inhibiting RNAs：efficient tools to inactivate oncogenic mutations and restore P53Pathways［J］.PNAS，2002，99（23）：14849－14854.

［25］CAO XIAOZHE，ZHU MINGHUA，ZHU ZHI，et al.Influence of P53small double stranded RNA interference on hepatoma cell line SK－Hep－1［J］.Chinese Journal of Cancer Research，2005，17（1）：22－27.

［26］廖維甲，梅銘惠，覃理靈，等.短發(fā)夾RNA對(duì)肝癌細(xì)胞細(xì)胞間粘附分子－1基因表達(dá)的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2006，10（6）：567－569.

［27］檀英霞，劉志玄，李素波，等.RNA干擾對(duì)肝素酶在肝癌細(xì)胞中表達(dá)及其腫瘤生長(zhǎng)抑制的作用［J］.世界華人消化雜志，2008，16（2）：138－143.

［28］蔣冬貴，夏昆，劉劫，等.RNA體外干擾肝癌 Hep－3B細(xì)胞VEGF基因的表達(dá)［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28（15）：1349－1351.

［29］張巖，胡美玉，陳碧華，等.膜－細(xì)胞骨架聯(lián)接分子ezrin對(duì)肝癌細(xì)胞系生長(zhǎng)和侵襲能力的影響［J］.中華肝臟病雜志，2006，14（7）：489－494.