曾 靜，易 斌，魯開智綜述，王曉斌審校

0 引 言

肝源性肺疾病肺血管重塑是多種慢性肝病作用于肺的共同病理生理改變。在此過程中，肝源性刺激因子(多種細胞因子)誘導肺微血管內(nèi)皮細胞(pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs)異常增殖和肌樣分化［1－2］，引起肺微血管擴張(pulmonary vaso dilatation，PVD)，從而導致血管中層PASMCs處于低氧環(huán)境;PASMCs從高分化的收縮型轉換為未分化的合成型，并從中膜遷移于內(nèi)膜異常增殖，最終導致肺血管重塑［3］。研究表明，肺血管重塑涉及多條信號通路，并與細胞骨架及膜系統(tǒng)密切相關;而ANNXⅠ/Ⅱ的膜聚集在細胞內(nèi)參與膜形成、膜轉運、細胞骨架的調(diào)控等重要生命過程［4］。因此，ANNXⅠ/Ⅱ的膜聚集在肝源性肺血管重塑中可能起著關鍵性作用。本文對ANNXⅠ/Ⅱ的膜聚集在肝源性肺血管重塑中的研究進展作一綜述。

1 ANNXⅠ/Ⅱ的結構

ANNX是一類結構相關鈣依賴性磷脂結合蛋白超家族［5］，分布于各種組織細胞的細胞核、細胞質以及細胞質膜外表面，具有多種生物學功能［6］。迄今為止，在不同種屬范圍內(nèi)，已發(fā)現(xiàn)160種以上的該家族成員，分為A(脊椎動物)、B(非脊椎動物)、C(單細胞真核生物)、D(植物)、E(原生生物)5組。脊椎動物細胞中的成員被定為膜聯(lián)蛋白A家族，有13個成員即A1～A13。結構上都具有由70個氨基酸殘基組成的4個保守重復序列結構(annexins A6有8個重復序列)，稱為中心結構域，其內(nèi)大約有40%～60%的氨基酸序列同源。不同的膜聯(lián)蛋白具有獨特的N端序列、獨特的基因表達方式和組織特異性。ANNXⅠ的基因定位于人染色體9q12-q21.2，編碼346個氨基酸殘基，組成了相對分子質量為37 000的ANNXⅠ蛋白［7］;其N端有44個氨基酸殘基，包含了磷酸化和蛋白水解位點，并以鈣依賴的方式與S100A11蛋白相互作用［8］。ANNXⅡ的基因定位于人染色體15q21-q22，編碼由339個氨基酸殘基組成的相對分子質量為36000的ANNXⅡ蛋白;其N-端有31個氨基酸殘基，包含S100A10蛋白(p11)和3個磷酸化位點(Ser11、Ser25、Tyr23)［9］。

2 ANNXⅠ/Ⅱ蛋白的膜聚集

目前的研究表明，炎癥、缺氧、腫瘤等環(huán)境下，ANNXⅠ/Ⅱ的N-末端結構域從第3重復序列形成的疏水結構中釋放出來，位于分子結構的凹面，通過與另1個ANNX的N-端螺旋形成二聚體，并與2個S100A11構成的二聚體連接起來，形成異四倍體樣結構(膜-ANNX-S100A11-S100A11-ANNX-膜)，由此引起膜聚集;ANNXⅠ通過N-端肽段與磷脂結合而產(chǎn)生1個α-螺旋二級結構，肽段形成1個兩性螺旋，一些側鏈插入磷脂，螺旋軸與膜平行，提示在膜聚集過程中，N-端結構域可能提供第2個膜結合位點［10］。研究提示，annexins A2存在不同的聚集形式:Ca2+缺乏時，以“伸展”形式的聚集形成膜橋。Ca2+存在時，膜聚集發(fā)生更迅速;表現(xiàn)為 S100A10定位于分子復合物中心的“關閉”形式，或“開放”形式的聚集導致S100A10暴露，從而與其他蛋白相互作用［11］。膜聚集后的 ANNXⅠ/Ⅱ的多個磷酸化位點暴露，ANNXⅠ的N端第21位的Tyr殘基被表皮生長因子受體(epidermal growth factor recrptor，EGFR)的酪氨酸蛋白激酶磷酸化，以及第27位的Ser殘基被蛋白激酶 C(protein kmase C，PKC)磷酸化。ANNXⅡ的N端Ser11和Ser25均可在PKC作用下發(fā)生磷酸化，Tyr23可被PP60v-src或其他多種膜結合激酶磷酸化修飾，如胰島素受體、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)受體、血小板衍生生長因子(platelet deriving growth factor，PDGF)受體等。磷酸化的ANNXⅠ/Ⅱ向細胞表面［12］、細胞核［13］或細胞內(nèi)膜轉位［14］，從而在細胞信號轉導、增殖、分化等方面發(fā)揮重要功能。ANNXⅠ/Ⅱ的膜聚集作用，在人體多種細胞內(nèi)參與蛋白跨膜轉運、蛋白運輸、膜形成、細胞骨架的形成、胞吞胞吐、細胞增殖、細胞遷移、分化及凋亡等一系列重要的生命過程。

3 膜聚集在肝源性肺血管重塑中的作用

肝源性肺疾病PMVECs異常增殖和肌樣分化，導致PVD;PVD是低氧血癥的病理基礎，而低氧作為主要的刺激因素，作用于 PASMCs，引起 ANNXⅠ/Ⅱ膜聚集，參與多條信號通路信息傳遞，調(diào)節(jié)細胞表型相關蛋白形成、轉運，導致PASMCs表型轉換，最終引起肺血管重塑。ANNXⅠ/Ⅱ可能是PASMCs表型轉換分子機制的關鍵變化，是眾多調(diào)節(jié)通路的“核心樞紐”，在肝源性肺血管重塑中發(fā)揮關鍵性調(diào)節(jié)作用。

3.1 調(diào)節(jié)重要信號通路蛋白的跨膜轉運及運輸 真核細胞的生長、分裂、生物合成、分泌等生命過程都伴隨著蛋白質在各細胞器之間的膜轉運、運輸，這對于信號途徑的傳導、調(diào)節(jié)乃至細胞的生命活動都起到非常關鍵性的作用。受到刺激后，ANNXⅠ/Ⅱ膜聚集，其N-端尾巴磷酸化影響與C-端中心結構域的結合，導致對蛋白酶解易感性的改變，修飾鈣敏感性和磷脂結合，其磷酸化調(diào)節(jié)囊泡運輸。ANNX被酪氨酸激酶磷酸化，參與受體觸發(fā)的胞吞作用和囊泡聚集［15］。研究表明，ANNXⅡ與囊泡釋放也存在關聯(lián)，ANNXⅡ增強肌動蛋白介導的囊泡釋放，使肌動蛋白結合至含有負電荷磷脂的囊泡。采用siRNA，ANNXⅡ干擾導致囊泡釋放減少，顯示ANNXⅡ對囊泡形成具有重要作用［16］。ANNXⅡ功能性地替代甲基纖維素，提示其對促進肌絲生長的成核有作用，ANNXⅡ使F-actin連接至囊泡膜。從而使激素和神經(jīng)遞質與細胞表面受體相互作用，啟動級聯(lián)反應，信息傳送至靶細胞內(nèi)。這個信號轉導過程，涉及連續(xù)的高度特異性的蛋白-蛋白相互作用。這些蛋白質可能形成可逆的蛋白復合物，以有序的方式在信號轉導過程中使信息傳送最大化。Creutz等［17］用原子力顯微鏡顯現(xiàn)了復合物的結構在體外的動力學形成，反映細胞膜上的ANNX和copineⅠ，證實它們能招募其他信號或膜運輸?shù)鞍字聊け砻?提示ANNXⅠ能改變膜結構，促進結構域形成，建立另外的結合空間與copineⅠ結合，進而copineⅠ在磷脂表面招募相互作用蛋白。ANNXⅠ/Ⅱ通過對囊泡運輸?shù)恼{(diào)節(jié)，參與大分子物質的出胞和入胞過程，從而介導信號分子的跨膜轉運及運輸，在多條信號通路中充當“樞紐”作用。

調(diào)節(jié)PASMCs表型轉換的信號通路中，多個關鍵性的調(diào)節(jié)蛋白如人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)、過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)調(diào)節(jié)蛋白等并未出現(xiàn)mRNA轉錄水平變化，但出現(xiàn)明顯的核轉移(跨核膜轉移)，阻斷這些蛋白的跨核膜轉移能明顯抑制PASMCs的增殖和遷移［18］，提示 ANNXⅠ/Ⅱ蛋白的跨膜轉運、運輸可能是調(diào)節(jié)PASMCs表型轉換乃至細胞遷移、增殖的防治新靶點。目前，此方面的報道甚少，尚需進一步研究。

3.2 調(diào)控細胞骨架 細胞骨架不僅在維持細胞形態(tài)、承受外力、保持細胞內(nèi)部結構的有序性方面起重要作用，而且還參與許多重要的生命過程。ANNXⅡ是頂端蛋白運輸裝置的重要成分，參與脂筏和肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)［19］。ANNXⅡN端 Tyr-23磷酸化，促使ANNXⅡ/p11轉位至細胞表面，通過啟動Ras同源物(Ras homalogne，Rho)/Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil protein kinase，ROCK)/LIM 激酶(LIM kinase，LIMK)/絲切蛋白(Cofilin)，誘導F-actin細胞骨架解聚，并牽引F-actin單體向細胞表層聚集，通過促進細胞膜局部突起、伸出偽足和管狀形成，介導細胞分支形態(tài)發(fā)生，降低細胞間固有的穩(wěn)定連接，導致細胞黏附喪失，參與細胞骨架調(diào)節(jié)蛋白Rho依賴的和肌動蛋白細胞骨架介導的細胞變形與遷移［20］。Babbin等［21］研究報道，敲除annexins A2后，檢測Rho的膜結合與激活，隨著annexins A2 siRNA轉染，Rho從膜解離，并且活性降低。提示ANNXⅡ對Rho向質膜的轉位發(fā)揮重要作用，ANNXⅡ通過靶向信號分子到膜結構域，發(fā)揮靶向Rho細胞膜轉位的作用，從而調(diào)節(jié) Rho相關信號轉導，調(diào)控細胞骨架重組。ANNXⅡ與肌動蛋白在激活細胞骨架重建的區(qū)域共定位。ANNXⅡ與肌動蛋白的相互作用是Ca2+依賴的。ANNXⅡ通過定位于富含自由鉤端和接近質膜的細胞質調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合。ANNXⅡ可能通過單體的分離和鉤端活性的封閉調(diào)節(jié)肌動蛋白纖維移動。許多細胞型的ANNXⅡ對于肌動蛋白肌絲動力學的調(diào)節(jié)，是一個有意義的參與者［22］。研究提供了關于ANNXⅡ功能的一個新觀點，ANNXⅡ不僅為肌動蛋白依賴的微胞飲小體運動所需要，而且提示了一個更為廣泛的作用，即ANNXⅡ在體內(nèi)對肌動蛋白動力學具有調(diào)節(jié)作用。

肌動蛋白細胞骨架的動力學變化是導致血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)分化的主要細胞內(nèi)信號之一。在早期表型轉換中，肌動蛋白細胞骨架的重組能調(diào)節(jié)平滑肌細胞(smooth muscle cell，SMC)的2個關鍵轉錄因子血清應答因子(serum nesponse factor，SRF)和心肌蛋白的表達，以及CArG盒依賴啟動子的活性。微絲抑制劑(latrunculm B，LatB)和(Jasplakinolide，Jasp)分別抑制VSMC和標記基因、SRF和心肌蛋白的增加。VSMC-特異基因的表達轉錄控制突出了CArG盒在SMC基因調(diào)控中的重要性。Zheng等［23］采用轉染試驗顯示，Jasp有意義的增加CArG盒依賴SMC啟動子的活性。因此，保證肌動蛋白細胞骨架的完整可能為血管疾病的進一步治療提供潛在的治療靶點。ANNXⅠ/Ⅱ通過對細胞骨架的調(diào)控，可能參與肝源性肺血管重塑的調(diào)節(jié)，具體機制有待研究證實。

3.3 參與膜形成 細胞膜和細胞器膜主要由脂質和蛋白質構成，含極少量的糖類物質。膜的形成既能維持穩(wěn)定的細胞內(nèi)環(huán)境，又能調(diào)節(jié)和選擇物質進出細胞。ANNXⅠ在多囊泡的胞內(nèi)體，控制細胞器膜的出芽和融合。ANNXⅠ二聚體或 ANNXⅠ/S100A11異四聚體與膜融合相關。膜囊泡從1個亞細胞定位到另1個細胞器的運輸，需要許多蛋白質和特定排序、修飾及多個脂質的降解，某些脂質能使二維膜變形，促進管狀形成和囊泡形成。多種蛋白質招募至這些位點以穩(wěn)定和增加管狀形成，并最終導致囊泡頸的關閉，胞內(nèi)體重新合成，這與皮層下肌動蛋白細胞骨架的局部解聚和細胞內(nèi)體重排的構象相關聯(lián)［24］。Kang 等［25］研究發(fā)現(xiàn)，ANNXⅠ在饑餓法誘導的自噬降解過程中明顯上調(diào)，提示ANNXⅠ在自噬的底物降解階段具有重要作用。ANNXⅠ可能促進自噬內(nèi)涵體的形成，進而促進自噬溶酶體的形成，降解其所含的內(nèi)容物。自噬促進細胞蛋白和亞細胞細胞器的降解，對于功能異常的細胞器和錯誤折疊的蛋白質顯示出重要的作用［26］，從而實現(xiàn)細胞穩(wěn)態(tài)和細胞器更新。ANNXⅠ可能通過自噬的調(diào)節(jié)，影響質膜以及細胞器膜上的蛋白質降解，進一步影響膜形成。既往研究表明，ANNXⅡ和spireⅠ的成核及F-actin的穩(wěn)定，為促進細胞內(nèi)體膜重建所必需。對于早期細胞內(nèi)體膜，ANNXⅡ在特定平臺組織有助于成核、錨點和穩(wěn)定肌動蛋白肌絲。肌動蛋白推動細胞內(nèi)體運輸中間體，推測ANNXⅡ有助于膜變形和成熟過程［27］。質膜損傷，ANNXⅠ/Ⅱ轉位至質膜，發(fā)生一個Ca2+觸發(fā)的融合反應，封閉損傷位點，提示ANNXⅠ/Ⅱ與質膜相互作用，促進膜分離、膜融合及在允許的空間限制內(nèi)依賴鈣敏感性的結合，對膜損傷作出等級反應。該過程有助于維持膜結構的完整［28］。

肝源性肺血管重塑，PAMSCs表型轉換過程中涉及一系列細胞器水平的變化，在高分化型(收縮型)VSMC粗面內(nèi)質網(wǎng)和高爾基體等細胞器減少，而低分化型(合成型)表現(xiàn)為肌纖維驟減，收縮功能消失，粗面內(nèi)質網(wǎng)、核糖體和高爾基體等細胞器增多。細胞膜細胞器膜的形成和解聚消失可能參與這一過程的調(diào)控。ANNXⅠ/Ⅱ與細胞膜及細胞器膜的形成有關，可能參與肝源性肺血管重塑的調(diào)控，尚需進一步研究。

4 展 望

目前，在肝源性肺血管重塑研究中，信號通路的報道較多，而針對蛋白的研究甚少。蛋白質的跨膜轉運、運輸可能是調(diào)節(jié)PASMCs表型轉換乃至細胞遷移、增殖的防治新靶點，較單一信號通路研究更有應用前景。ANNXⅠ/Ⅱ的膜聚集作用在PASMCs表型轉換分子機制中可能起到“樞紐”作用?？梢灶A料，隨著對ANNXⅠ/Ⅱ研究的深入，其結構和膜聚集作用及在肝源性肺血管重塑中的作用會被逐漸闡明，這將為肝源性肺血管重塑的基因治療探索一個更有價值的新靶點。

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