郭春霞,張曉雷,邵水金△,郝 莉,朱 晶
(1.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203;2海綠谷制藥有限公司,上海 201203)
帕金森病 (Parkinson’s disease,PD)又稱震顫麻痹,是一種多發(fā)于中老年人的常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,臨床以靜止性震顫、運動遲緩等為主要特征,尚有語言減少和聲音低沉單調(diào)、吞咽困難、流涎、睡眠障礙、抑郁或癡呆等癥狀,嚴重影響患者的運動能力和生活質(zhì)量。由于PD的病因尚未完全明確,于是提出各種假說,如遺傳因素學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說、環(huán)境因素學(xué)說、細胞凋亡學(xué)說等。而氧化應(yīng)激學(xué)說在PD的發(fā)病中仍占主導(dǎo)地位[1-3]。此外,由于 PD是一種慢性進展性疾病,目前尚無根治的方法,治療以左旋多巴等藥物為主,但只能緩解臨床癥狀,且療效遞減性以及副作用 (抑郁、焦慮、幻覺、欣快、精神錯亂、輕度躁狂等)一直是困擾人們的難題。近年來,針灸以其自身優(yōu)勢,在改善PD的運動障礙、延緩PD進程、減少左旋多巴的毒副作用、提高患者的生活質(zhì)量等方面已發(fā)揮了重要作用,逐漸受到人們的重視,針灸因此成為治療帕金森病的方法之一[4]。本研究通過觀察電針“百會”、“風(fēng)府”和“陽陵泉”對帕金森病模型大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響,探討電針對帕金森病可能的作用機制。
SPF級雄性SD大鼠60只,體重180~220g,由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供,許可證號:SYXK(滬)2004-2005。
藥物及試劑:美多芭 (上海羅氏制藥公司,批號SH11687),6-羥基多巴胺 (美國 Sigma公司,批號048k3728)、阿撲嗎啡 (美國 Sigma公司,批號100839-200601)、抗壞血酸 (美國Sigma公司,批號063k1082),慶大霉素 (上海第一制藥廠),丙二醛 (MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽 (GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒 (南京建成生物工程研究所),戊巴比妥鈉 (上海中西藥業(yè)股份有限公司,批號WS20090920),冰醋酸 (國藥集團化學(xué)試劑有限公司),等。
儀器:TOW-3A型大鼠腦立體定位儀 (廣東汕頭市教育醫(yī)學(xué)儀器廠),XW-80A型旋渦混合器 (上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠),UV754N型紫外分光光度計 (上海精密科學(xué)儀器有限公司),華佗牌針灸針 (蘇州醫(yī)療用品廠),KWD-808型全能脈沖電療儀 (上海電子儀器廠)等。
采用經(jīng)典的PD模型[5]。術(shù)前按常規(guī)進行行為測試,確認無異常旋轉(zhuǎn)行為后,用戊巴比妥鈉(3%的戊巴比妥鈉,50mg/kg)腹腔注射麻醉。然后將大鼠固定于腦立體定位儀上,頭部去毛,苯扎溴銨常規(guī)消毒。無菌條件下,沿正中線切開大鼠顱頂皮膚,剝離骨膜,暴露前囟。以前囟為準,根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜[6],確定右側(cè)黑質(zhì)二坐標:①前囟后5.2mm,正中線右側(cè)1.0mm,硬膜下9.0mm。②前囟后5.2mm,正中線右側(cè)2.5mm,硬膜下8.5mm。用顱骨鉆于手術(shù)要求部位小心鉆開顱骨,用5μL微量進樣器將6-OHDA(溶于含0.02%抗壞血酸的生理鹽水中,即秤量藥品抗壞血酸0.001g,溶于生理鹽水0.5mL中)注入右側(cè)黑質(zhì)部 (以1.0 mm/min速度緩慢進針),每孔3μL,注射速度為1μL/min,注射完畢后留針5min,然后以1.0 mm/min速度緩慢退針。手術(shù)完成后,用醫(yī)用明膠海綿填塞顱骨孔,縫合切口皮膚,肌肉注射慶大霉素7d,待動物清醒后放回飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)。正常對照組只固定大鼠,不進行任何處理。
10d后,以腹腔注射APO 0.5mg/kg誘發(fā)大鼠向一側(cè)旋轉(zhuǎn),記錄從開始旋轉(zhuǎn)至30min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù),以旋轉(zhuǎn)圈數(shù)平均>7次/min者為合格的PD模型[7]。
將成功PD模型大鼠 (31只)隨機分為4組:①電針組9只:采用類比法取穴,腧穴定位如下:風(fēng)府:在大鼠頭項部,枕外隆凸直下凹陷處;百會:在大鼠頭頂部,兩耳尖連線的中點處;陽陵泉:在大鼠小腿外側(cè),膝關(guān)節(jié)下外1.5cm處。用0.25×13mm的針灸針,刺0.6~1cm深,稍行提插捻轉(zhuǎn)手法。使用全能脈沖電療儀,正、負電極輸出線分別夾在“百會”、 “風(fēng)府”和雙側(cè)“陽陵泉”穴位上的毫針針柄上。選用斷續(xù)波型,電針頻率為5hz,電流強度為20mA左右,以肌肉出現(xiàn)輕微抽動為準。每次刺激時間為15min,每日1次,每周6次,共治療4周。②美多芭組8只:灌胃給藥,劑量135mg/kg(10mL/kg),每日1次,每周6次,共給藥4周。③電針結(jié)合美多芭組8只:方法如電針組治療結(jié)合美多芭組治療,每日1次,每周6次,共治療4周。④模型組6只:不做任何處理。正常對照組6只也不做任何處理。各組除干預(yù)措施不同外,其余各條件一律相同。
治療結(jié)束后,立即斷頭取腦,小心分離黑質(zhì),制備腦黑質(zhì)勻漿液。操作方法:取腦黑質(zhì),在冰冷的生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙拭干,放入10 mL的勻漿管內(nèi);在勻漿管中加冷的0.86%鹽水0.65mL,用眼科剪盡快剪碎腦黑質(zhì)塊;再加入冷的0.86%生理鹽水0.3mL進行充分勻漿。將勻漿液以4000r/min離心15min,將上清液置-20℃冰箱中備用[8]。
氧自由基檢測方法:取適量上清液進行MDA,GSH,GSH-Px和SOD的檢測,具體方法按南京建成生物工程研究所試劑盒說明書步驟進行測試。
實驗數(shù)據(jù)用 (mean±s)表示,兩組間各參數(shù)比較采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件,t檢驗方法進行統(tǒng)計學(xué)分析,其中P<0.05說明兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.01說明兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
動物造模成功率57.41%.與正常對照組比較,模型組SOD活性降低,MDA含量升高,GSH含量降低,GSH-PX活性降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。與模型組比較,電針組、美多芭組、電針+美多芭組均能提高SOD、GSH-Px活性,提高GSH含量和降低MDA含量,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。而美多芭組,電針組和電針+美多芭組黑質(zhì)中SOD、MDA、GSH和GSH-Px含量測定結(jié)果比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05)。(見表1)
《資生經(jīng)》曰: “百會”又名天滿,屬督脈,為督脈與足太陽、手足少陽和足厥陰五條經(jīng)脈之所會,故有“三陽五會”之稱, 《針灸大成》中稱“主心煩悶,驚悸健忘,忘前失后,心神恍惚”,具開竅醒神之功,針刺“百會”可以激發(fā)頭部和諸經(jīng)經(jīng)氣,治療腦病和十四經(jīng)病,調(diào)一身之陰陽氣血,補腦益髓。風(fēng)府穴出自《素問》,“頭重,身痛,惡寒,治在風(fēng)府”,《備急千金要方》風(fēng)府主治“舌緩,不能言”,這些臨床癥狀似屬于帕金森病癥狀范疇;針刺風(fēng)府穴可以振奮督脈陽氣,宣散風(fēng)邪,調(diào)理氣血,使經(jīng)脈氣血疏通,臨床帕金森病治療有較多應(yīng)用。陽陵泉穴始出自《靈樞·邪氣臟腑病形》篇,是足少陽膽經(jīng)合穴,又是八會穴之一的“筋會”,位于小腿外側(cè)當(dāng)腓骨頭前下方凹陷處,是臨床的常用穴;具有強健腰膝、通絡(luò)止痛等功效;近年來,陽陵泉穴單穴或處方配穴應(yīng)用治療多種疾病,如肩周炎、膝關(guān)節(jié)炎、面肌痙攣、偏癱、坐骨神經(jīng)痛、扭挫傷等病證;臨床研究認為針刺陽陵泉,對調(diào)整腦血流量有一定影響,對急性缺血性中風(fēng)患者,通過針刺治療取得良好療效[9]?;谏鲜鲈蚣捌渑R床在治療帕金森病的應(yīng)用,本實驗針對性的選擇“百會”、 “風(fēng)府”和“陽陵泉”三穴,并考察電針該三穴位對帕金森病模型大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響,探討電針對帕金森病可能的作用機制。
本實驗結(jié)果表明,模型組與正常對照組比較,SOD活性降低,MDA含量升高,GSH含量降低,GSH-PX活性降低,提示帕金森病大鼠的氧化反應(yīng)被激活,處于氧化應(yīng)激狀態(tài);同時說明機體清除氧自由基的能力低,細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性受損,機體細胞受自由基攻擊的程度加重。與模型組比較,美多芭組、電針組、電針結(jié)合美多芭組均能提高SOD活性,提高GSH-Px活性,提高GSH含量和降低MDA含量,說明三種治療方法均能使機體清除氧自由基的能力提高,機體細胞受自由基攻擊的程度減輕,對細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性起到保護的作用。而美多芭組,電針組和電針結(jié)合美多芭組組間測定結(jié)果比較,差異多無統(tǒng)計學(xué)意義,說明此三種治療方法誰更略勝一籌,尚無定論。通過本實驗可以推測,電針治療清除過氧化脂質(zhì)及自由基,提高機體抗氧化能力的作用機制,可能與其對機體的多方面調(diào)節(jié)作用有關(guān),電針通過局部治療與整體調(diào)節(jié)作用,達到了對自由基的清除作用,從而使機體免受自由基的損害。
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