孫夢君 綜述;孫 穎，徐 艷 審校

(南京醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究所，南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周科，江蘇 南京 210029)

內(nèi)毒素(endotoxin)又稱脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，是G-菌細(xì)胞壁外膜的重要組成成分，可引起一系列的炎癥反應(yīng)，在G-菌感染中起重要作用。LPS反復(fù)刺激可能引起機體對后續(xù)刺激的反應(yīng)性降低，產(chǎn)生耐受現(xiàn)象，即內(nèi)毒素耐受(endotoxin tolerance)，是機體防御機制的重要組成部分。在牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中，牙周組織持續(xù)暴露于各種不同的細(xì)菌和毒性產(chǎn)物環(huán)境中，其誘導(dǎo)的耐受反應(yīng)可能是宿主下調(diào)炎癥反應(yīng)，避免組織損傷的途徑之一［1］。近年來，有關(guān)牙周致病菌內(nèi)毒素耐受的研究已有較多報道，本文就這方面的研究進展作一綜述。

1 內(nèi)毒素耐受和交叉耐受(cross tolerance)

目前，關(guān)于內(nèi)毒素耐受的研究多集中于單核/巨噬細(xì)胞，主要表現(xiàn)為選擇性的基因和蛋白表達水平的改變，其中大部分表達下調(diào)的都是炎癥因子，例如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素 -1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6和IL-12，以及趨化因子，例如 CCL3、CCL4和 CXCL10;表達上調(diào)的主要是抗炎因子，例如IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子 -β(transforming growth factor-β，TGF-β)和IL-1受體拮抗劑(interleukin-1 receptor antagonist，IL-1RA)等［2-3］。就功能而言，耐受細(xì)胞主要表現(xiàn)為抗原提呈能力受損，但吞噬能力增強(表面受體CD64表達上調(diào))，殺滅內(nèi)吞的病原體的能力不受影響或減弱［4］。除了單核/巨噬細(xì)胞，內(nèi)毒素耐受還可能發(fā)生在其他免疫細(xì)胞，例如樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，以及部分組織細(xì)胞，例如腸上皮細(xì)胞［5-6］。另外，內(nèi)毒素耐受現(xiàn)象在動物模型和人體中也有報道［7-8］。

研究發(fā)現(xiàn):牙周炎病人的牙齦組織可能處于內(nèi)毒素耐受狀態(tài)，盡管TLR2、4陽性細(xì)胞浸潤增多，但是 TLR2、4 mRNA表達水平卻是下調(diào)的［1］。另外，從牙周炎病人牙齦組織中分離的單核細(xì)胞也處于內(nèi)毒素耐受狀態(tài)，與健康對照相比，他們上調(diào)TLR2、4 和 IL-1β 的能力下降［9］。

內(nèi)毒素耐受并不是特異性的，不同的LPS，甚至與LPS不具備結(jié)構(gòu)同源性的刺激物也可誘導(dǎo)細(xì)胞對后續(xù)LPS的刺激產(chǎn)生耐受，即交叉耐受。例如大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)LPS和牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pgs)LPS可以相互誘導(dǎo)耐受［10］;TNF-α預(yù)刺激可使后續(xù)LPS刺激引起的炎性因子分泌減少，小鼠死亡率降低［8］。

2 內(nèi)毒素耐受的機制

內(nèi)毒素耐受的機制與Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)信號傳導(dǎo)有關(guān)，TLRs是一種表達于哺乳動物和人體細(xì)胞表面的模式識別受體，可以識別微生物的保守結(jié)構(gòu)，即病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)。TLRs識別PAMPs后可以啟動胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，刺激細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子、共刺激分子和主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ(major histocompatibility complex classⅡ，MHC Ⅱ)，從而啟動獲得性免疫反應(yīng)［11］。

目前，已發(fā)現(xiàn)13種不同的TLRs，而不同TLR與不同配體識別有關(guān)。TLR2可以識別肽聚糖、脂磷壁酸、脂蛋白、以Pg為代表的某些G-菌的LPS和Pg菌毛等毒力因子;TLR4主要識別以E.coli為代表的絕大多數(shù)G-菌的LPS［11］。

內(nèi)毒素耐受的發(fā)生可能涉及TLRs信號途徑中的多種受體、轉(zhuǎn)接分子、信號分子和轉(zhuǎn)錄因子表達水平的改變，例如TLR2、4表達下調(diào);IL-1受體相關(guān)激酶-1、4(interleukin-1 receptor-associated kinase-1、4，IRAK-1、4)的降解;絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)和核因子 -κB(nuclear factor-kappa B ，NF-κB)的活化受損等［1，5］。TLRs信號傳導(dǎo)途徑的負(fù)性調(diào)節(jié)因子在內(nèi)毒素耐受中也可能發(fā)揮了重要的作用，例如IRAK-M、含Src同源區(qū)2的肌醇磷脂酶(Src homology 2 containing inositol phosphatase，SHIP)和細(xì)胞因子信號抑制物-1(suppressor of cytokine-signaling-1，SOCS-1)等［3-4，8-9］。最近研究發(fā)現(xiàn):染色質(zhì)修飾和小RNA干擾也可能與內(nèi)毒素耐受有關(guān)［12-13］。

3 牙周致病菌與內(nèi)毒素耐受

3.1 Pg

Pg是牙周主要致病菌之一，常從慢性牙周炎病人的牙周袋中分離得到，可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎因子。大量證據(jù)表明:Pg LPS 主要通過 TLR2 傳遞信號［11，14］。但也有報道稱:Pg LPS可以活化 TLR4［15］。引起這些差異的主要原因可能是Pg LPS在提取過程中被其他可以活化TLR4的物質(zhì)污染，或其脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致TLR活化特性改變。

Pg LPS誘導(dǎo)內(nèi)毒素耐受的能力弱于 E.coli LPS。Zaric等研究發(fā)現(xiàn):E.coli LPS重復(fù)刺激后，THP-1細(xì)胞分泌的IL-8和TNF-α明顯減少，小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞分泌的角質(zhì)形成細(xì)胞衍生細(xì)胞因子(keratinocyto-derived Cytokine，KC)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白2(macrophage inflammatory protein 2，MIP-2)和TNF-α減少，但Pg LPS重復(fù)刺激后，僅TNF-α減少，而 IL-8、KC 和 MIP-2 分泌持續(xù)增多［10］。采用E.coli LPS重復(fù)刺激THP-1細(xì)胞后，細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β和TNF-α都減少;而Pg LPS重復(fù)刺激后，僅 IL-1β 減少，TNF-α 不變甚至增多［14］。

Pg LPS和E.coli LPS誘導(dǎo)內(nèi)毒素耐受的能力不同，可能與兩者在一次和二次刺激時對TLRs表達的影響不同有關(guān)。Muthukuru等發(fā)現(xiàn):E.coli LPS重復(fù)刺激誘導(dǎo)TLR2、4 mRNA和蛋白下調(diào)的能力均強于 Pg LPS［1］。Martin 認(rèn)為:E.coli LPS 刺激后，THP-1細(xì)胞表面TLR4表達明顯下調(diào)，而Pg LPS刺激后，TLR2 明顯上調(diào)［14］。Hajishengallis等也認(rèn)為:Pg LPS刺激細(xì)胞后引起的TLR2表達上調(diào)可能與再次刺激后TNF-α的增多有關(guān)［16］。

Pg LPS和 E.coli LPS誘導(dǎo) NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，I-κB)降解和 NF-κB 活化的能力不同，可能也與其誘導(dǎo)內(nèi)毒素耐受的能力不同有關(guān)。Martin等采用E.coli LPS重復(fù)刺激后，細(xì)胞降解I-κB-α和I-κB-β的能力下降，但Pg LPS重復(fù)刺激后，細(xì)胞保持了降解I-κB-β的能力［14］。Zaric等則認(rèn)為Pg LPS重復(fù)刺激后仍能誘導(dǎo)細(xì)胞IκB-α 降解［10］。Hajishengallis 等采用 E.coli LPS預(yù)刺激，E.coli LPS或 Pg LPS再次刺激后，NF-κB p50和p65亞基都下調(diào);而Pg LPS預(yù)刺激，E.coli LPS或Pg LPS再次刺激，NF-κB p50和p65亞基都上調(diào)［16］。由于Pg LPS重復(fù)刺激后，細(xì)胞仍能有效降解部分I-κB，活化NF-κB，因此，其誘導(dǎo)的某些炎性因子的下調(diào)可能與NF-κB無關(guān)，而存在其他調(diào)節(jié)機制。Zaric認(rèn)為Pg LPS重復(fù)刺激后，細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α減少可能是因為TNF-α啟動子區(qū)組蛋白H3的二甲基化引起了基因沉默［10］。Hajishengallis則認(rèn)為Pg LPS重復(fù)刺激后IL-1β的下調(diào)可能是因為Pg LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生了IL-1RA，可以阻止IL-1β與IL-1R結(jié)合，抑制IL-1β的正反饋回路，從而下調(diào) IL-1β［16］。

Pg LPS誘導(dǎo)的耐受可能影響抗原提呈細(xì)胞的功能。Cohen等采用Pg LPS重復(fù)刺激人單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和 THP-1細(xì)胞后，共刺激分子CD80、CD86表達下調(diào)，趨化因子CCL3和CCL5也受到抑制［17］。Muthukuru等也發(fā)現(xiàn):Pg LPS重復(fù)刺激人外周血單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞對Pg的攝取能力增強，但是，耐受細(xì)胞中的人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-DR和共刺激分子CD40、CD86表達下調(diào)，誘導(dǎo)自體CD4加T細(xì)胞增殖的能力也減弱［18］。這些研究表明:Pg LPS引起的耐受雖然有利于避免過度的炎癥性組織損傷，但可能減弱了抗原提呈細(xì)胞的提呈功能，從而抑制了牙周炎病人的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。

另外，Ara等采用Pg LPS重復(fù)刺激人牙齦成纖維細(xì)胞(human gingival fibroblast，HGF)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分泌IL-6和IL-8未下調(diào)，也不表達負(fù)性調(diào)節(jié)因子SOCS-1、IRAK-M和SHIP-1。由此認(rèn)為，HGF在Pg LPS重復(fù)刺激后不產(chǎn)生耐受，可能在維持牙周炎癥中發(fā)揮了一定作用［19］。

3.2 伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans，Aa)

Aa是另一種牙周主要致病菌，與侵襲性牙周炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其LPS主要通過TLR4傳遞信號。Gloria等采用CD14、TLR4和TLR2抗體對HGF進行預(yù)處理發(fā)現(xiàn)，只有CD14和TLR4抗體可以抑制Aa LPS誘導(dǎo)的胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2 磷酸化，而TLR2抗體不能，提示CD14和TLR4在識別Aa LPS 中起重要作用［20］。

Aa LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素耐受對各種炎性因子的調(diào)節(jié)作用不同。Tanabe等發(fā)現(xiàn):Aa LPS重復(fù)刺激人巨噬細(xì)胞后，TNF-α分泌減少，而IL-1β、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)分泌增多，IL-6、IL-8和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)則保持不變。因此推測:Aa LPS重復(fù)刺激可能參與調(diào)節(jié)牙周組織的炎癥狀態(tài)，與疾病的間歇性相關(guān)［21］。Nakamura等采用小劑量Aa LPS對健康全血樣本進行預(yù)刺激，再次刺激時其分泌的IL-1β和IL-6明顯增多，IL-10和TNF-α雖增多，但沒有顯著差異。流式細(xì)胞檢測分析胞質(zhì)內(nèi)染色顯示，單核細(xì)胞是產(chǎn)生IL-1β和IL-6的主要細(xì)胞，其次是多形核中性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞未見染色［22］。這些研究表明:Aa LPS重復(fù)刺激后，盡管一些特異性促炎因子分泌減少，但也有一些炎癥介質(zhì)或組織降解酶增多。因此，Aa LPS是否可以誘導(dǎo)耐受，這種耐受對于宿主究竟是有利還是有害，仍不能下定論。

關(guān)于Aa LPS誘導(dǎo)耐受的機制研究較少，Tanabe等在誘導(dǎo)耐受時加入磷脂酰肌醇-3’-激酶(Phosphatidylinositol-3’-kinase，PI3K)抑制劑，抑制了Aa LPS重復(fù)刺激后IL-1β的增多，但對TNF-α無影響，進而推斷，Aa LPS重復(fù)刺激人巨噬細(xì)胞后，IL-1β和TNF-α的分泌可能是通過不同的信號途徑進行調(diào)節(jié)的［21］。

3.3 齒垢密螺旋體(Treponema denticola，Td)

Td是一種G-厭氧螺旋體，與牙周炎和壞死性潰瘍性齦炎有關(guān)，其在牙菌斑中的數(shù)量與牙周病的嚴(yán)重性相關(guān)。Gabriel等發(fā)現(xiàn):小鼠巨噬細(xì)胞通過TLR2識別 Td及其主要外鞘蛋白(major outer sheath protein，MSP)，通過TLR4識別其脂寡糖(lipooligosaccharide，LOS)。采用干擾素 -γ(gamma interferon，IFN-γ)或增加Td的量可使細(xì)胞在缺乏TLR2的情況下活化。因此認(rèn)為:Td可以通過TLR2活化小鼠巨噬細(xì)胞，但也存在另一種受體，這種受體識別依賴于感染部位螺旋體的量及IFN-γ的水平［23］。

研究發(fā)現(xiàn):Td表面成分可誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受。Gabriel等發(fā)現(xiàn)LOS和MSP都可誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞對后續(xù)的明尼蘇達沙門菌LPS刺激產(chǎn)生耐受，使細(xì)胞分泌的一氧化氮減少。因此推測Td表面成分誘導(dǎo)的耐受可能是混合感染時細(xì)菌逃避清除的機制之一［23］。

綜上所述，目前對于牙周致病菌內(nèi)毒素耐受的研究主要集中于Pg，對其他致病菌的研究相對較少。牙周組織內(nèi)毒素耐受的體內(nèi)研究較少，體外研究則主要集中于免疫細(xì)胞，對牙周組織細(xì)胞的研究相對較少。另外，各研究之間存在較大的差異性，可能與使用的LPS類型和劑量、細(xì)胞類型以及檢測時間不同等有關(guān)。內(nèi)毒素耐受在減輕組織損傷的同時也不利于感染的控制，對于牙周組織的健康究竟是有利還是有害，仍不能下定論。上述問題還有待將來深入的研究。

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