張 蓓，李亞軍，張世俊，任會(huì)云，王敏娟，郭長(zhǎng)江

（西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安710077）

腦紅蛋白在腦梗死大鼠腦組織中的表達(dá)及其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制

張 蓓，李亞軍，張世俊，任會(huì)云，王敏娟，郭長(zhǎng)江

（西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安710077）

目的：觀察腦梗死大鼠腦組織中腦紅蛋白 （Ngb）的表達(dá)及其對(duì)PI3K／Akt信號(hào)通路的影響，探討二者在缺血性腦損傷中的作用及Ngb神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制。方法：60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血組、Hemin（Ngb誘導(dǎo)劑）組、LY （PI3－K／Akt抑制劑LY294002）組和Hemin＋LY組，每組12只。應(yīng)用大腦中動(dòng)脈線栓法制備腦梗死動(dòng)物模型，術(shù)后24h觀察各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和腦組織梗死體積；應(yīng)用RT－PCR法檢測(cè)各組大鼠腦組織Ngb mRNA表達(dá)水平及PI3－K／Akt活性。結(jié)果：假手術(shù)組未見(jiàn)TTC不著色區(qū)，未檢出神經(jīng)功能缺損。與缺血組比較，Hemin組大鼠腦組織中Ngb和Akt mRNA表達(dá)水平升高 （P＜0.01），神經(jīng)功能評(píng)分降低 （P＜0.05），腦梗死體積減小 （P＜0.01）；與缺血組比較，LY組大鼠腦梗死體積增加 （P＜0.01），神經(jīng)功能評(píng)分升高 （P＜0.05），Akt mRNA表達(dá)水平降低 （P＜0.01），Ngb無(wú)明顯變化。與 Hemin組比較，Hemin＋LY組大鼠腦組織損傷加重，Akt mRNA表達(dá)水平明顯降低 （P＜0.01），Ngb未被抑制。結(jié)論：Ngb可以減小局灶性腦缺血大鼠腦梗死體積，改善神經(jīng)功能，并且可能通過(guò)PI3K／Akt信號(hào)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

腦紅蛋白；磷脂酰肌醇－3激酶／絲氨酸－蘇氨酸蛋白激酶；腦梗死

腦血管病是危害極大的常見(jiàn)病、多發(fā)病，目前尚缺乏切實(shí)有效的腦保護(hù)劑。腦紅蛋白（neuroglobin，Ngb）是近年發(fā)現(xiàn)的一種主要表達(dá)于腦內(nèi)神經(jīng)元的攜氧球蛋白。腦缺血缺氧時(shí)，Ngb在神經(jīng)元中高度表達(dá)，并可作為一種內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子增強(qiáng)腦組織對(duì)缺血－缺氧損傷的耐受［1］，但其確切機(jī)制尚不明確，國(guó)內(nèi)外罕見(jiàn)其信號(hào)通路的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。氯化高鐵血紅蛋白 （Hemin）又名正鐵血紅素，臨床上廣泛應(yīng)用于治療貧血。Hemin在細(xì)胞和整體水平均能誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞Ngb高表達(dá)［2－3］。本研究旨在進(jìn)一步觀察Ngb對(duì)腦梗死大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，并探討其是否通過(guò)激活磷脂酰肌醇－3 激 酶 （phosphoinositide－3kinase，PI3K）／絲氨酸－蘇氨酸蛋白激酶 （serine／threonine kinase，Akt）信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)；揭示這一保護(hù)作用的具體機(jī)制及可能涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不僅為開(kāi)展Ngb的臨床應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)，而且有可能為缺血性卒中甚至各種原因?qū)е碌娜毖跣阅X損傷帶來(lái)全新的、可行的治療方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康成年雄性SD大鼠60只 （西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量 （280±20）g，隨機(jī)平均分為假手術(shù)組、缺血組、Hemin組 （于術(shù)后1h腹腔注射Ngb誘導(dǎo)劑 Hemin 50mg·kg－1）、LY組 （PI3K／Akt抑制劑LY294002，0.3mg·kg－1于栓塞前15min經(jīng)尾靜脈給藥）和Hemin＋LY組 （于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)分別給予Hemin和LY294002），每組12只。

1.2 主要試劑 Trizol試劑盒 （Gibco公司），逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒 （Takara公司），PCR擴(kuò)增試劑盒和DNA梯度Marker（Takara公司），RNA提取試劑盒 （Tiangen公司），Hemin（上海麗珠生物技術(shù)有限公司），LY294002（Santa Cruz公司）。

1.3 動(dòng)物模型制備 參照 Zea－longa法［4］改良后制作右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模型：大鼠經(jīng)10%水合氯醛 （0.3mg·kg－1）腹腔注射麻醉后仰臥位固定，備皮，消毒，沿頸前正中線切開(kāi)皮膚，逐層分離，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈 （CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈 （ICA），結(jié)扎ECA及CCA近心端，經(jīng)CCA近分叉處切口插入線栓 （4－0單絲尼龍手術(shù)縫合線，頭端加熱成直徑0.3mm光滑球形，酒精消毒、肝素浸泡后備用），進(jìn)入ICA 18～20mm至大腦中動(dòng)脈起始處，結(jié)扎固定線栓。假手術(shù)組僅分離暴露頸部動(dòng)脈不阻斷血流。

1.4 大鼠神經(jīng)功能評(píng)定 術(shù)前及術(shù)后24h參照Z(yǔ)ea－longa［4］標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)定。0分：無(wú)神經(jīng)功能缺損；1分：不能完全伸展左側(cè)前爪；2分：向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時(shí)向左側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，有意識(shí)障礙。1～4分視為造模成功，術(shù)前評(píng)分大于0分及術(shù)后評(píng)0分或術(shù)后24h內(nèi)死亡者剔除，并隨機(jī)補(bǔ)足。

1.5 大鼠腦梗死體積測(cè)定 每組各取6只大鼠于術(shù)后24h斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，以前囟 （Bregma）為標(biāo)志點(diǎn)，從Bregma＋4.0mm～Bregma－8.0mm，以2mm間隔行連續(xù)冠狀切片，共6片，放入1%紅四氮唑 （TTC）磷酸鹽緩沖液中 （pH ＝7.4），37℃孵育30min。正常大鼠腦組織著深紅色，梗死灶呈蒼白色。4%多聚甲醛固定，拍照，利用Photoshop等軟件計(jì)算腦梗死體積。腦梗死體積計(jì)算公式：V＝t× （A1＋A2＋…An），V代表腦梗死體積，t代表腦片的厚度，A代表腦片的梗死面積。

1.6 RT－PCR方法檢測(cè)大鼠腦組織中Ngb及Akt mRNA表達(dá)水平 每組動(dòng)物各取6只，術(shù)后24h斷頭取腦，迅速置于液氮中保存?zhèn)溆?。①基因引物：采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。Ngb上游序列，5′－AGCCGCAGCCCTCTGGAACA－3′，下游序列5′－GCAGCATCAATCACAAGCA－3′， 擴(kuò) 增 長(zhǎng) 度176bp；Akt 上 游 序 列，5′－CTGGCCAGGCCCAAGCACCG－3′，下 游 序 列，5′－CGTTCACTGTCCACACACTC－3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度109bp；GAPDH 為 內(nèi) 參 照，上 游 序 列，5′－ACCACCATGGAGAAGGCTGG－3′，下游序列，5′－CTCAGTGTAGCCCAGGATGC－3′，擴(kuò) 增 長(zhǎng) 度 為 528bp。②腦組織總RNA的提?。菏褂每俁NA提取試劑盒，按其說(shuō)明提取大鼠腦組織總RNA，并經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量。③RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。④RT－PCR反應(yīng)：94℃預(yù)變性2min；94℃、1min，55℃、1min，72℃、1.5min，共 28 個(gè) 循 環(huán)；72℃延伸7min。⑤采用紫外－凝膠成像分析系統(tǒng)（Alphalmager2200）記錄電泳結(jié)果，采用Image J軟件定量分析電泳結(jié)果。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織Ngb及Akt mRNA的表達(dá)水平以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠死亡率比較 假手術(shù)組大鼠無(wú)死亡，缺血組和LY組各死亡2只，Hemin組死亡1只（術(shù)中損傷迷走神經(jīng)迅速死于急性肺水腫），Hemin＋LY組死亡1只。以上大鼠不進(jìn)入統(tǒng)計(jì)，另隨機(jī)選取大鼠補(bǔ)齊。各組大鼠死亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。

2.2 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死體積 假手術(shù)組全部大鼠未檢測(cè)到神經(jīng)功能缺損 （0分），其余各組大鼠術(shù)后24h均有不同程度的神經(jīng)功能缺損：Hemin組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯低于缺血組（P＜0.05），LY組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分高于缺血組（P＜0.05），Hemin＋LY組與缺血組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。假手術(shù)組大鼠腦組織未見(jiàn)TTC不著色區(qū)，Hemin組腦梗死體積小于缺血組 （P＜0.01）。LY組腦梗死體積大于缺血組 （P＜0.01）；Hemin＋LY組腦梗死體積小于 LY 組 （P＜0.01），大于 Hemin組（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死體積Tab.1 Neurological function score and cerebral infarction volume of rats in various groups （±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死體積Tab.1 Neurological function score and cerebral infarction volume of rats in various groups （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs ischemia group ；△P＜0.01 vs Hemin group；＃P＜0.01 vs LY group.

Group Neurological scoreCerebral infarction volume（V／mm3）eration 0 0 Ischemia 2.98±0.76 179.50±3.94 Hemin 2.13±0.54＊ 86.67±5.89＊＊LY 3.42±1.01＊ 225.00±3.46＊＊Hemin＋LY 2.87±0.62△＃ 188.67±2.42＊△＃Sham op

2.3 各組大鼠腦組織中Ngb和Akt mRNA的表達(dá)水平 假手術(shù)組大鼠腦組織Ngb mRNA僅有少量表達(dá)。與假手術(shù)組比較，缺血組大鼠腦組織中Ngb mRNA表達(dá)水平明顯增高 （P＜0.01），但Akt mRNA表達(dá)水平降低 （P＜0.01）。與缺血組比較，Hemin組大鼠腦組織中Ngb和Akt mRNA表達(dá)水平均升高 （P＜0.01）；LY組Akt mRNA表達(dá)水平降低 （P＜0.01），Ngb mRNA無(wú)明顯變化（P＞0.05）；Hemin＋LY組Ngb mRNA被誘導(dǎo)高表達(dá) （P＜0.01），Akt mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與Hemin組比較，Hemin＋LY組大鼠腦組織中Akt mRNA表達(dá)水平明顯降低 （P＜0.01），Ngb mRNA表達(dá)水平兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。與LY組比較，Hemin＋LY組大鼠腦組織中Ngb和Akt mRNA均在Hemin誘導(dǎo)下表達(dá)水平升高 （P＜0.01）。見(jiàn)圖1和表2。

圖1 各組大鼠腦組織中Ngb和Akt mRNA表達(dá)電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of Ngb and Akt mRNA in brain tissue of rats in various groupsLane 1：Sham operation group；Lane 2：Ischemia group；Lane 3：Hemin group；Lane 4：LY group；Lane 5：Hemin＋LY group.

表2 RT－PCR檢測(cè)各組大鼠腦組織中Ngb和Akt mRNA表達(dá)水平Tab.2 RT－PCR analysis of expression levels of Ngb and Akt mRNA in brain tissue of rats in various groups（n＝6，±s）

表2 RT－PCR檢測(cè)各組大鼠腦組織中Ngb和Akt mRNA表達(dá)水平Tab.2 RT－PCR analysis of expression levels of Ngb and Akt mRNA in brain tissue of rats in various groups（n＝6，±s）

＊P＜0.01 vs sham operation group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs ischemia group；＃P＜0.01 vs Hemin group；○P＜0.01 vs LY group.

eration 1.18±0.07 0.28±0.04 Ischemia 0.90±0.01＊ 0.46±0.02＊Hemin 1.02±0.07△△ 1.03±0.00△△LY 0.47±0.02△△ 0.44±0.03 Hemin＋LY 0.80±0.05△?！?0.89±0.05 b mRNA Sham op Group Expression of Akt mRNA Expression of Ng△△○

3 討 論

腦血管病具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高和復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，是老年人致死和致殘的重要原因。選擇有效靶點(diǎn)、改善缺血部位對(duì)缺血缺氧的耐受性、延長(zhǎng)缺血組織和細(xì)胞發(fā)生不可逆損傷前的時(shí)間是目前治療缺血性腦血管病亟需解決的問(wèn)題。

Ngb是2000年由德國(guó)科學(xué)家Burmester等［5］首先報(bào)道的、主要存在于脊椎動(dòng)物腦內(nèi)的一種新的攜氧珠蛋白，其與氧具有很高的親和力，并可以與氧可逆地結(jié)合，協(xié)助氧透過(guò)血腦屏障，增加代謝活躍的神經(jīng)組織的氧供。在腦缺血缺氧、氧化應(yīng)激和毒物損傷等病理情況下，Ngb的表達(dá)均有不同程度的增加。Ngb神經(jīng)保護(hù)作用的確切機(jī)制尚不清楚，研究［6－9］發(fā)現(xiàn)：Hgb可能通過(guò)儲(chǔ)存氧和協(xié)助氧在細(xì)胞內(nèi)向線粒體擴(kuò)散、清除活性氧自由基和氮自由基及作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的調(diào)節(jié)子調(diào)節(jié)一個(gè)G－蛋白偶聯(lián)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路這3條途徑發(fā)揮作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在缺血前腹腔注射Hemin可上調(diào)大鼠腦組織中Ngb mRNA表達(dá)水平，同時(shí)Hemin組動(dòng)物腦缺血后神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積均較缺血組有明顯改善，進(jìn)一步證實(shí)了Ngb對(duì)局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，而且Hemin能誘導(dǎo)Ngb表達(dá)增加從而減輕腦損傷。Hemin調(diào)控Ngb表達(dá)的機(jī)制尚不十分清楚，可能由可溶性鳥(niǎo)氨酸環(huán)化酶－蛋白激酶G通路介導(dǎo)［2］，但是否還存在其他機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

PI3K／Akt信號(hào)途徑是腦缺血后與細(xì)胞損傷有關(guān)的重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與了腦缺血的病理過(guò)程，且與腦缺血損傷程度有關(guān)。多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通過(guò)激活PI3K／Akt信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮腦保護(hù)作用［10］。PI3K是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，激活后在質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3，進(jìn)一步引起信號(hào)蛋白Akt活化?；罨腁kt通過(guò)磷酸化作用激活或抑制其下游效應(yīng)分子的激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和遷移等，故Akt作為PI3K下游的直接靶蛋白，可反映PI3K／Akt信號(hào)通路的活性變化。LY294002是目前應(yīng)用較廣泛的PI3K／Akt特異性抑制劑，通過(guò)特異性抑制PI3K p110亞單位的催化活性，阻礙下游底物PIP3的產(chǎn)生，使該通路處于失活狀態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：栓塞前給予特異性PI3K／Akt通路阻斷劑LY294002不僅增大了大鼠腦梗死體積、加重了神經(jīng)功能缺損，而且抑制了Akt mRNA表達(dá)水平，但Ngb的表達(dá)與缺血組比較無(wú)差異；而在Ngb誘導(dǎo)劑Hemin的干預(yù)下，Akt mRNA的表達(dá)和Ngb均升高，大鼠腦組織損傷亦同時(shí)減輕，從而推斷腦梗死大鼠Ngb可能通過(guò)激活PI3K／Akt信號(hào)通路發(fā)揮腦保護(hù)作用。缺血組大鼠腦組織Akt mRNA表達(dá)較假手術(shù)組降低，與缺血后Ngb的變化趨勢(shì)不同，這與Zhao等［11］的報(bào)道一致，考慮與腦梗死24h缺血半暗帶內(nèi)PI3K／Akt細(xì)胞信號(hào)幾乎衰竭及其促細(xì)胞存活生物學(xué)效應(yīng)減弱有關(guān)，亦提示PI3K／Akt信號(hào)通路參與了腦梗死大鼠腦組織損傷過(guò)程。LY294002通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合PI3K的ATP結(jié)合位點(diǎn)，阻斷PIP3的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制Akt的磷酸化以抑制PI3K／Akt信號(hào)通路的活性，理論上對(duì)Akt mRNA表達(dá)水平干預(yù)作用甚小。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與張繼紅等［12］和朱建峰等［13］的研究結(jié)果一致，考慮可能與實(shí)驗(yàn)條件、樣本量和反饋調(diào)節(jié)機(jī)制等有關(guān)。本研究?jī)H從基因水平對(duì)Ngb的腦保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，證實(shí)了PI3K／Akt通路可能介導(dǎo)了腦缺血后Ngb的神經(jīng)保護(hù)作用，但尚需進(jìn)一步從蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證。

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Expression of neuroglobin in brain tissue of rats with cerebral infarction and its neuroprotective mechanisms

ZHANG Bei，LI Ya－jun，ZHANG Shi－jun，REN Hui－yun，WANG Min－juan，GUO Chang－jiang
（Department of Neurology，Affiliated Hospital，Xi’an Medical University，Xi’an 710077，China）

ObjectiveTo observe the expression of neuroglobin （Ngb）in brain tissue of rats with cerebral infarction and its effect on PI3－K／Akt signaling pathway，and to study their effects on cerebral ischemic injury and the possible mechanisms of the neuroprotective effect of Ngb.Methods60SD rats were randomly divided into sham operation group，ischemia group，and Hemin group，LY group，and Hemin＋LY group，and there were 12rats in each group.Cerebral infarction models were established by middle cerebral artery thread embolism method.All rats were sacrificed 24hafter operation for neurological evaluation and detection of cerebral infarction volume，and the expression levels of Ngb and Akt mRNA were detected by RT－PCR.ResultsThere was not any area unstained by triphenyltetrazolium chloride and any neurologic impairment found in rats in sham operation group.Compared with ischemia group，the expression levels of Ngb and Akt mRNA in Hemin group were increased significantly （P＜0.01），with better neurological function （P＜0.05）and less volume of cerebral infarction （P＜0.01）.The volume of cerebral infarction （P＜0.01）and the neurological impairments（P＜0.05）in LY group were increased，and the expression level of Akt mRNA in LY group was lower（P＜0.01）than that in ischemia group，and there was no significant difference in the expression of Ngb（P＞0.05）.The cerebral tissue damage in Hemin＋LY group was aggrevated，and the expression level of Akt mRNA was decreased（P＜0.01），while the level of Ngb mRNA was not inhibited by LY294002（P＞0.05）compared with Hemin group.ConclusionNgb can reduce the volume of cerebral infarction and improve neurological function after focal cerebral ischemia in rats and its neuroprotective effect may be realized by activating PI3－K／Akt signaling pathway.

neuroglobin；phosphoinositide－3kinase／serine－threonine kinase；cerebral infarction

R743.33

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1114－05

2012－07－26

陜西省自然科學(xué)基金資助課題 （2010JM4054）；陜西省教育廳科研基金資助課題 （09JK713）

張 蓓 （1980－），女，山東省濟(jì)寧市人，主治醫(yī)師，講師，在讀醫(yī)學(xué)博士，主要從事腦血管病發(fā)病機(jī)制的研究。

李亞軍 （Tel：029－84277893，E－mail：liyajun9＠hotmail.com）