張 莎，袁 君，張貴星，張菊娥

鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室鄭州 450001

#通訊作者，女，1953年10月生，碩士，教授，研究方向:腫瘤酶學(xué)，E-mail:Zje8866@126.com

表沒食子兒茶素沒食子酸酯對A549細(xì)胞增殖、凋亡和hTERT表達(dá)的影響

張 莎，袁 君，張貴星，張菊娥#

鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室鄭州 450001

#通訊作者，女，1953年10月生，碩士，教授，研究方向:腫瘤酶學(xué)，E-mail:Zje8866@126.com

表沒食子兒茶素沒食子酸酯;人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶;肺腫瘤;A549細(xì)胞

目的:探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對人肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞增殖、凋亡及人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)表達(dá)的影響。方法:用0、50、100、150、200、250 mg/L EGCG分別作用A549細(xì)胞24、48和72 h后，MTT比色法檢測細(xì)胞增殖抑制率;0、100、200、250 mg/L EGCG干預(yù)48 h后，應(yīng)用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測A549細(xì)胞的凋亡情況，應(yīng)用RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)分別檢測細(xì)胞內(nèi)hTERT mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果:EGCG可抑制A549細(xì)胞的增殖，并隨著劑量增加和時間延長，抑制率增加(F組間=185.944，F(xiàn)時間=291.234，F(xiàn)交互= 4 186.119，P均＜0.001)。EGCG促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡(F=2 757.183，P＜0.001)，還可抑制 A549細(xì)胞中hTERT mRNA與蛋白的表達(dá)(F=260.861和953.327，P均＜0.001)。結(jié)論:EGCG能有效地抑制 A549細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，其機制可能與下調(diào)hTERT的表達(dá)有關(guān)。

端粒酶的活化是腫瘤發(fā)生中最普遍的事件，人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)作為調(diào)節(jié)端粒酶活性的主要因子在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，因此也成為了近年來腫瘤靶向治療領(lǐng)域的研究熱點。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是綠茶茶多酚中生物活性最強的單體，作為一種傳統(tǒng)的中藥成分，其藥理作用主要表現(xiàn)為抗氧化、抗炎癥、抗突變、抗腫瘤生成、抑制端粒酶活性等［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)其對乳癌［3］、肝癌［4］、喉癌［5］等都有一定的抑制作用，同時能使癌組織端粒酶活性降低，hTERT表達(dá)減少。作者檢測了EGCG對人肺腺癌細(xì)胞株A549增殖、凋亡以及hTERT表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討其抗腫瘤作用的可能機制，以期為肺癌的治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 A549細(xì)胞由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室傳代并保存。EGCG購自成都曼思特公司;DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清為美國Gibco公司產(chǎn)品;MTT購自美國Sigma公司;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒為南京凱基生物有限公司產(chǎn)品;RNAiso Plus、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Premix Taq Version 2.0等購自TaKaRa公司;兔抗人hTERT多克隆抗體為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品;SP免疫組化試劑盒為北京中杉金橋服務(wù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 A549細(xì)胞增殖情況的檢測 采用MTT法。取對數(shù)生長期的A549常規(guī)消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為4×107L－1，接種于96孔板中，每孔0.2 mL。培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為50、100、150、200、250 mg/L的EGCG，以只加等體積培養(yǎng)基的細(xì)胞作為對照，同時設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基的調(diào)零孔，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。分別在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48和72 h后，各孔加5 g/L的MTT溶液20 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h，小心吸棄上清，每孔加入150 μL的DMSO。酶標(biāo)儀上測定其在490 nm處的吸光度(A)值，計算各時間點的細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率 =(1－處理組 A值/對照組 A值)×100%。實驗重復(fù)3次。

1.3 A549細(xì)胞凋亡情況的檢測 采用Annexin VFITC/PI雙染法檢測。取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，用DMEM高糖完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2×108L－1，接種于培養(yǎng)瓶中，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日每瓶加入不同質(zhì)量濃度的EGCG，使藥物終濃度分別為0、100、200、250 mg/L。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取出A549細(xì)胞，用不含EDTA的胰酶消化并收集細(xì)胞。加PBS 6 mL洗滌，2 000 r/ min離心5 min，重復(fù)2次，收集1×106個細(xì)胞于EP管中。加入0.5 mL的Binding Buffer，使細(xì)胞懸浮。加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，再加入 5 μL PI，混勻，室溫、避光孵育15 min。在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。實驗重復(fù)3次。

1.4 A549細(xì)胞中hTERT mRNA的檢測 采用RT-PCR法檢測。按照 RNAiso Plus試劑說明書提取EGCG處理48 h后A549細(xì)胞的總RNA并定量，經(jīng)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。根據(jù)Genbank資料，用Primer Premier 5軟件設(shè)計hTERT引物序列。hTERT上游:5’-TCACCTCGAGGGTGAAGGCACTGTT-3’，下游:5’-ATGCTGGCGATGACCTCCGTGA-3’，擴增片段大小230 bp。內(nèi)參 β-actin上游:5’-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3’，下游:5’-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA-3’，擴增片段大小139 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系:2×premix Taq 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，cDNA模板1 μL，補雙蒸水至20 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃3 min;94℃ 45 s，60℃30 s，72℃1 min，35個循環(huán);72℃ 10 min。RTPCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并拍照。

1.5 A549細(xì)胞內(nèi)hTERT蛋白的檢測 采用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，用DMEM高糖完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為4×107L－1，每孔2 mL，接種于鋪有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中。次日吸去培養(yǎng)基，分別加入含不同質(zhì)量濃度的EGCG(0、100、200、250 mg/L)的培養(yǎng)基，48 h后終止培養(yǎng)，PBS沖洗2次，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次。之后加入體積分?jǐn)?shù)為1%的Triton-X溶液通透20 min，浸入PBS中洗3次。實驗參照免疫組化 SP試劑盒說明書進(jìn)行。hTERT稀釋一抗100倍后使用，以PBS代替一抗作為陰性對照。高倍鏡下選取5個視野觀察，IPP 6.0軟件分析結(jié)果，計算各視野的平均光密度值(AOD)值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0分析。EGCG對A549細(xì)胞增殖活性的影響采用析因設(shè)計的方差分析，各組A549細(xì)胞凋亡率、hTERT mRNA和蛋白表達(dá)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 EGCG對A549細(xì)胞增殖活性的影響 A549細(xì)胞增殖抑制率測定結(jié)果見表1。

表1 EGCG對A549細(xì)胞增殖抑制率的影響(n=3)%

2.2 EGCG對A549細(xì)胞凋亡的影響 見表2。

表2 EGCG干預(yù)48 h后各組A549細(xì)胞凋亡率和hTERT表達(dá)的比較(n=3)

2.3 EGCG對A549細(xì)胞hTERT mRNA表達(dá)的影響 見圖1、表2。

2.4 EGCG對A549細(xì)胞hTERT蛋白表達(dá)的影響見圖2、表2。hTERT蛋白主要表達(dá)于胞質(zhì)，胞核中有少量表達(dá)，呈黃色或棕褐色。

圖1 PCR擴增hTERT基因瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖2 A549細(xì)胞中hTERT蛋白的表達(dá)(SP，×400)

3 討論

EGCG能抑制多種腫瘤細(xì)胞生長并促其凋亡，而對人體的正常細(xì)胞幾乎無毒副作用［5-7］。該研究結(jié)果顯示EGCG的濃度在50～250 mg/L時，隨著EGCG劑量的增加及作用時間的延長，A549細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，表明EGCG能夠抑制A549細(xì)胞生長，其作用呈現(xiàn)時間及劑量的依賴關(guān)系。在該濃度范圍內(nèi)，EGCG作用48 h后，A549細(xì)胞的凋亡率隨著給藥濃度的增加而升高，EGCG促進(jìn)了A549細(xì)胞的凋亡。

端粒是存在于真核細(xì)胞線狀染色體末端的DNA重復(fù)序列，其主要功能是維持染色體的穩(wěn)定性。hTERT是端粒酶必需的催化亞單位，它只特異性地在端粒酶陽性的腫瘤細(xì)胞和永生化細(xì)胞中表達(dá)，而正常細(xì)胞中幾乎檢測不到［2，8］。A549細(xì)胞為端粒酶陽性表達(dá)細(xì)胞，是端粒酶研究中較理想的實驗?zāi)Ｐ?。該研究發(fā)現(xiàn)隨著EGCG作用濃度的增加，A549細(xì)胞中hTERT mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯受到抑制。因此推測EGCG抑制A549細(xì)胞生長可能與其促凋亡作用有關(guān)，而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能機制在于下調(diào)hTERT的表達(dá)。

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Effects of epigallocatechin-3-gallate on growth and hTERT expression of A549 cells

ZHANG Sha，YUAN Jun，ZHANG Guixing，ZHANG Ju’eDepartment of Biochemistry and Molecular Biology，College of Basic Medical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001

epigallocatechin-3-gallate;human telomerase reverse transcriptase;lung neoplasm;A549 cell

Aim:To investigate the effects of epigallocatechin-3-gallate(EGCG)on proliferation and apoptosis and the expression of human telomerase reverse transcriptase(hTERT)of human lung adenocarcinoma cell line A549.Methods:A549 cells were treated with 0，50，100，150，200，250 mg/L EGCG for 24，48，and 72 h，respectively.MTT assay was used to detect the inhibitory rate of cell proliferation.Flow cytometry with Annexin V-FITC/PI double staining was employed to analyze the apoptosis of A549 cells treated with various concentrations of EGCG(0，100，200，250 mg/L)for 48 h，and RTPCR and immunocytochemistry were applied to detect the mRNA and protein expression of hTERT.Results:EGCG inhibited the cell proliferation of A549 in a dose dependent manner(Fgroup=185.944，F(xiàn)time=291.234，F(xiàn)interaction=4 186.119，P＜0.001)，and promoted the apoptosis of A549 cells(F=2 757.183，P＜0.001).EGCG could suppress the mRNA and protein expression of hTERT(F=260.861 and 953.327，P＜0.001).Conclusion:EGCG can effectively inhibit cell proliferation and induce apoptosis of A549 cells，which may be associated with downregulation of hTERT expression.

R734.2

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.018

(2012-03-01收稿 責(zé)任編輯李沛寰)