耿莉娜，韓麗萍，張曉雪，李萌萌，趙先蘭

鄭州大學第一附屬醫(yī)院婦產科鄭州 450052

#通訊作者，女，1969年8月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向:婦科內分泌與腫瘤，E-mail:hanlp0825@yahoo.com.cn

子癇前期患者胎盤組織和人臍靜脈內皮細胞中即刻早期反應基因X-1蛋白的表達

耿莉娜，韓麗萍#，張曉雪，李萌萌，趙先蘭

鄭州大學第一附屬醫(yī)院婦產科鄭州 450052

#通訊作者，女，1969年8月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向:婦科內分泌與腫瘤，E-mail:hanlp0825@yahoo.com.cn

即刻早期反應基因X-1;子癇前期;胎盤;人臍靜脈內皮細胞

目的:探討子癇前期(PE)患者胎盤組織和人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)中即刻早期反應基因X-1(IEX-1)蛋白的表達。方法:應用免疫組化SP法檢測10例輕度PE、20例重度PE患者和20例正常足月孕婦(正常妊娠組)胎盤組織中IEX-1蛋白的表達。將HUVEC分別用胎牛血清(陰性對照組)、正常晚孕婦靜脈血清(正常妊娠組)和重度PE患者血清(重度PE組)孵育24 h，然后應用細胞免疫化學法檢測細胞中IEX-1蛋白的表達，采用MTT法檢測細胞增殖抑制率。結果:IEX-1蛋白主要表達于胎盤絨毛滋養(yǎng)細胞及蛻膜細胞的胞質，3組胎盤絨毛滋養(yǎng)細胞及底蛻膜細胞中的表達差異有統計學意義(H=26.620、16.932，P＜0.001)，重度PE組的表達強于輕度PE組(P＜0.05)，輕度PE組強于正常妊娠組(P＜0.05)。正常妊娠組及重度PE組HUVEC胞質中有IEX-1蛋白的表達，且較陰性對照組明顯增強(H=11.495，P=0.003)。陰性對照組、正常妊娠組和重度PE組HUVEC細胞增殖抑制率差異有統計學意義(F=113.438，P＜0.001)，重度PE組高于其他2組(P＜0.05)。結論:IEX-1可能通過調節(jié)滋養(yǎng)細胞及蛻膜細胞凋亡，參與內皮細胞損傷過程，在PE發(fā)病中起著重要作用。

子癇前期(preeclampsia，PE)是人類妊娠期所特有的疾病，以蛋白尿和高血壓為主要特征，是導致圍產期孕產婦和嬰兒病率及死亡率增高的重要原因之一，其病理機制可能與血管內皮損傷、母-胎免疫平衡失調、滋養(yǎng)細胞缺血等有關。即刻早期反應基因X-1(immediate early response gene X-1，IEX-1)作為“即刻早期基因”成員，能在生長因子、炎癥因子及缺血缺氧等因素誘導下快速表達，進而調控細胞的生長、增殖、分化和凋亡等各過程［1-5］。作者對PE患者胎盤組織和人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)中IEX-1的表達進行檢測，探討其與PE發(fā)病的關系。

1 材料與方法

1.1 胎盤標本的來源及處理

1.1.1 臨床資料 選取2010年9月至12月在鄭州大學第一附屬醫(yī)院住院分娩的50例產婦作為研究對象，其中PE患者30例(包括輕度PE 10例，重度PE 20例)，正常晚孕婦20例(正常妊娠組)。輕度PE、重度PE和正常妊娠組的年齡分別為21～40 (31.5±5.6)歲、22～41(32.1±5.6)歲、22～38 (29±4.4)歲;孕周分別為35+1～40+2(37.6±1.1)周、34+3～39+3(36.7±0.9)周、36～41+5(38.3± 1.2)周。PE的診斷標準參照《婦產科學》第 7版［5］，均排除有糖尿病、心臟病、免疫系統疾病、肝腎疾病等慢性疾病史的孕婦。

1.1.2 胎盤標本 胎盤自然娩出后，迅速選取母面中央約1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm兩塊，避開出血、鈣化、機化的部位，用生理鹽水反復漂洗后，置入甲醛溶液固定。將胎盤組織常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，用于免疫組化測定。收集10例重度PE患者和正常晚孕婦靜脈血各5 mL，制備血清備用。

1.2 HUVEC的來源及處理 HUVECY購自美國ATTCC細胞庫，常規(guī)培養(yǎng)于含體積分數12%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，常規(guī)加青霉素400萬U/ L、鏈霉素100萬U/L。培養(yǎng)條件為37℃、體積分數5%CO2飽和濕度，2～3 d更換一次培養(yǎng)液。待細胞長滿瓶底時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。

1.3 檢測指標

1.3.1 胎盤組織中IEX-1蛋白檢測 切片常規(guī)脫蠟至水并微波修復抗原。采用免疫組化SP法檢測，按免疫組化SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)說明書進行操作。一抗為兔抗IEX-1多克隆抗體［2］(按300倍稀釋)，DAB顯色，蘇木精輕度復染。以PBS代替一抗作為空白對照，采用已知IEX-1蛋白表達陽性的卵巢組織石蠟切片作為陽性對照。陽性細胞主要表現為胞質棕色、褐色著色。根據陽性細胞分布和細胞染色強度確定IEX-1的表達水平。首先，高倍鏡下選取5個視野，每個視野計數100個細胞，計算陽性細胞百分比，0%計為0分，＜25%為1分，25%～為2分，＞50%為3分。再根據細胞染色強度計分:無染色或染色不清為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深黃色或褐色為3分。取以上2項的乘積:積分0～1為陰性(－);2～3分為弱陽性(+);4～5分為陽性();＞5分為強陽性()。

1.3.2HUVEC中IEX-1蛋白檢測 將HUVEC經胰酶消化收集后，分別以5×105個/孔接種于含載玻片的6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)。至對數生長期時分為陰性對照組、正常妊娠組和重度PE組3組，分別用含體積分數12%胎牛血清、含體積分數12%正常晚孕婦靜脈血清和含體積分數12%重度PE患者血清的RPMI 1640培養(yǎng)液孵育細胞。培養(yǎng)24 h，當細胞至80%～90%融合后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗細胞3次，多聚甲醛固定，用Triton液進行細胞通透，用體積分數5%～10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉。在細胞爬片上滴加一抗工作液IEX-1(按300倍稀釋)，37℃孵育1～2 h。PBS沖洗5 min×3次。滴加生物素標記二抗工作液，37℃孵育10～30 min; DAB顯色，蘇木精復染后常規(guī)脫水、透明、封片。鏡下觀察并攝片。以PBS代替一抗作為空白對照，用已知陽性切片作陽性對照。結果判定方法同1.3.1。

1.3.3HUVEC細胞增殖能力測定 將HUVEC以5×105個/孔接種在96孔板內，細胞分組及培養(yǎng)同1.3.2，每組設3個復孔。培養(yǎng)24 h后，采用MTT法測定細胞增殖能力，按試劑盒說明操作，檢測波長490 nm，細胞增殖抑制率=(1－實驗組吸光度值/對照組吸光度值)×100%。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0進行分析，采用秩和檢驗分析3種胎盤組織及3組HUVEC中IEX-1蛋白的表達水平，用單因素方差分析及LSD-t檢驗比較3組細胞增殖抑制率，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 輕、重度PE患者及正常妊娠組胎盤組織中IEX-1蛋白的表達 3組胎盤組織中均可檢測到IEX-1蛋白，主要表達于合體滋養(yǎng)細胞和蛻膜細胞，少量表達于絨毛間質和血管內皮細胞。PE組胎盤滋養(yǎng)細胞和底蛻膜細胞中IEX-1的表達均較正常妊娠組增強，重度PE組表達較輕度PE組增強。見圖 1、表1。 *H=26.020，P＜0.001;△H=16.932，P＜0.001。

圖1 3組胎盤組織中IEX-1蛋白的表達(SP，×400)

表1 3組胎盤組織中IEX-1蛋白表達情況比較

2.23組HUVEC中IEX-1蛋白的表達 見圖2、表2。由圖2、表2可以看出，陰性對照組HUVEC胞質有極少量IEX-1蛋白的表達，正常妊娠組及重度PE組IEX-1蛋白的表達較陽性對照組明顯增強。

圖23 組HUVEC中IEX-1蛋白的表達(SP，×400)

表23 組HUVEC中IEX-1蛋白表達的比較 陽性例數

2.3 3組HUVEC增殖抑制率的比較 陰性對照組、正常妊娠組和重度PE組細胞增殖抑制率分別為(0.160±0.021)%、(0.197±0.012)%和(0.480± 0.015)%，3組比較，差異有統計學意義(F= 113.438，P＜0.001)，重度PE組HUVEC增殖抑制率高于其他2組(P＜0.05)。

3 討論

人類胎盤形成的關鍵是滋養(yǎng)細胞向母體子宮內膜和肌層的成功浸潤，該過程需滋養(yǎng)細胞增殖、分化和侵蝕及蛻膜細胞的增殖與退化同時并存，并在動態(tài)平衡中協調蛻膜細胞的數量和滋養(yǎng)細胞的侵蝕，若該平衡紊亂，可能導致一系列的病理性妊娠［6-7］。研究［8］發(fā)現PE患者存在胎盤淺著床和子宮螺旋動脈重建失敗，這些變化可能與滋養(yǎng)細胞及蛻膜細胞的生物學效應改變有關。正常妊娠過程中存在滋養(yǎng)細胞正常凋亡現象，而PE患者胎盤組織中存在細胞過度凋亡現象，提示胎盤滋養(yǎng)細胞異常凋亡與PE的發(fā)病密切相關。

IEX-1屬即刻早期基因家族成員，能在外界信號刺激下快速、短暫地表達，介導細胞內信號轉導，調控下游長期反應基因的表達，在細胞生長、增殖、分化和凋亡等方面發(fā)揮著重要作用［1-4］，與病毒感染、心血管疾病、炎癥的免疫調控及腫瘤發(fā)生發(fā)展等密切相關［9-12］。已有研究［12］發(fā)現IEX-1可通過調節(jié)活化T細胞中ERK信號通路發(fā)揮抗凋亡作用。推測IEX-1可能參與了細胞內不同的信號傳導通路(如 NF-κB、ERK、ROS、PI3K/Akt等)［12-14］，從而使細胞適應外界環(huán)境的變化。

該研究結果表明，正常妊娠產婦和PE患者的胎盤組織內均有IEX-1的表達，主要表達于合體滋養(yǎng)細胞和蛻膜細胞，PE患者胎盤組織中IEX-1蛋白的表達明顯強于正常妊娠組，且隨病情嚴重程度的增加而增強。推測PE患者全身小血管痙攣，各臟器血液灌注減少，胎盤存在缺血缺氧，從而誘導了細胞中應激蛋白IEX-1的表達。作者進一步用PE患者靜脈血清干預HUVEC，觀察內皮細胞增殖能力以及IEX-1合成能力。結果顯示，正常情況下HUVEC中有極少量IEX-1蛋白表達，用正常妊娠孕婦及重度PE患者的血清孵育后，IEX-1蛋白在HUVEC中的表達明顯增強，同時重度PE組HUVEC增殖能力明顯下降，說明PE患者血清誘導了HUVEC中IEX-1蛋白的表達，同時還可使HUVEC受損，推測IEX-1蛋白在PE內皮細胞損傷過程中可能起重要的橋梁作用。

目前IEX-1在PE胎盤組織以及內皮細胞損傷過程中的具體作用及調控機制尚不完全清楚，不能確定IEX-1的異常表達究竟是PE的原因抑或是疾病的結果。進一步深入研究IEX-1在胎盤細胞凋亡及內皮細胞損傷過程的調節(jié)機制，可增加對PE發(fā)病機制的認識，可能從蛋白和(或)基因水平找到新的干預靶點，為PE的診治及預后判斷提供新途徑。

［1］Arlt A，Grobe O，Sieke A，et al.Expression of the NF-kappa B target gene IEX-1(p22/PRG1)does not prevent cell death but instead triggers apoptosis in Hela cells［J］.Oncogene，2001，20(1):69

［2］Shen L，Guo J，Santos-Berrios C，et al.Distinct domains for anti-and pro-apoptotic activities of IEX-1［J］.J Biol Chem，2006，281(22):15304

［3］Han LP，Geng LN，Liu XR，et al.Clinical significance of IEX-1 expression in ovarian carcinoma［J］.Ultrastruct Pathol，2011，35(6):260

［4］Wu MX.Roles of the stress-induced gene IEX-1 in regulation of cell death and oncogenesis［J］.Apoptosis，2003，8 (1):11

［5］樂杰，謝杰，豐有吉.婦產科學［M］.7版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2007:456

［6］Sharp AN，Heazell AEP，Crockerl IP，et al.Placental apoptosis in health and disease［J］.Am J Reprod Immunol，2010，64(3):159

［7］Alexander D，Allai RE，Kelly A，et al.Placental apoptosis in pre-clampsia［J］.Obstet Gynecol，2000，96(2):271

［8］Kadyrov M，Kingdom JC，Huppertz B.Divergent trophoblast invasion and apoptosis in placental bed spiral arteries from pregnancies complicated by maternal anemia and early onset preeclampsia/intrauterine growth restriction［J］.Am J Obstet Gynecol，2006，194(2):557

［9］Taddeo B，Esclatine A，Zhang W，et al.The stress-inducible immediate-early responsive gene IEX-1 is activated in cells infected with herpes simplex virus 1，but several viral mechanisms，including 3’degradation of its RNA，preclude expression of the gene［J］.Virology，2003，77(11):6178

［10］Sommer SL，Berndt TJ，Frank E，et al.Elevated blood pressure and cardiac hypertrophy after ablation of the gly96/ IEX-1 gene［J］.J Appl Physiol，2006，100(2):707

［11］Sasada T，Azuma K，Hirai T，Hashida H，et al.Prognostic significance of the immediate early response gene X-1(IEX-1)expression in pancreatic cancer［J］.Ann Surg Oncol，2008，15(2):609

［12］Zhang Y，Finegold MJ，Porteu F，et al.Development of t-cell lymphomas in Emu-IEX-1 mice［J］.Oncogene，2003，22 (44):6845

［13］Shen L，Zhi L，Hu W，et al.IEX-1 targets mitochondrial F1Fo-ATPase inhibitor for degradation［J］.Cell Death Differ，2009，16(4):603

［14］Osawa Y，Nagaki M，Banno Y，et al.Expression of the NF-kappa B target gene X-ray-inducible immediate early response factor-1 short enhances TNF-alpha-induced hepatocyte apoptosis by inhibiting Akt activation［J］.J Immunol，2003，170(8):4053

Expression of immediate early response gene X-1 protein in placenta of preeclampsia patients and human umbilical vein endothelial cells

GENG Lina，HAN Liping，ZHANG Xiaoxue，LI Mengmeng，ZHAO XianlanDepartment of Obstetrics and Gynecology，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052

immediate early response gene X-1;preeclampsia;placenta;human umbilical vein endothelial cell

Aim:To explore immediate early response gene X-1(IEX-1)protein expression in preeclampsia(PE)placenta and human umbilical vein endothelial cells(HUVECs).Methods:Thirty patients with PE(10 cases were mild，and 20 cases were severe)and 20 normal pregnant women(control group)were subjected to detect IEX-1 protein in placenta using immunohistochemistry.HUVECs were cultured with fetal calf serum(negative control group)，the serum of normal pregnant women(normal control group)，and the serum of severe PE patients(severe PE group)for 24 h，respectively，then the IEX-1 expression in the cells was detected by immunocytochemical method，and the proliferation inhibition rate was detected by MTT.Results:The expression of IEX-1 protein mainly lay in cytoplasm of placental trophoblast cells and decidual cells.There were significant differences in the expression of IEX-1 protein in placental trophoblast cells and decidual cells among the 3 groups(H=26.620，16.932，P＜0.001)，which as the highest in the severe PE group(P＜0.05)，and lowest in the control group(P＜0.05).IEX-1 expression in HUVECs of the normal control group and severe PE group were stronger than that of negative control group(H=11.495，P=0.003).The difference in proliferation inhibition rate of HUVECs among the 3 groups was significant(F=113.438，P＜0.001)，and that of severe PE group was higher than the other 2 groups(P＜0.05).Conclusion:IEX-1 may play an important role in the pathogenesis of PE through regulating placental villous trophoblast cells and decidual cells apoptosis，as well as participation in endothelial cell injury process.

R714.24

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.016

(2012-01-03收稿 責任編輯王 曼)