劉紹霞，張立英，趙國強，張國俊#

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科鄭州 450052 2)鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院微生物學與免疫學教研室鄭州 450001

#通訊作者，男，1966年10月生，博士，主任醫(yī)師，教授，研究方向:間質(zhì)性肺疾病的發(fā)病機制及治療，E-mail:zlgj_001@126.com

腺病毒siRNA沉默TGF-β1對肺間質(zhì)纖維化大鼠TGF-β1的表達及Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的影響*

劉紹霞1)，張立英1)，趙國強2)，張國俊1)#

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科鄭州 450052 2)鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院微生物學與免疫學教研室鄭州 450001

#通訊作者，男，1966年10月生，博士，主任醫(yī)師，教授，研究方向:間質(zhì)性肺疾病的發(fā)病機制及治療，E-mail:zlgj_001@126.com

肺間質(zhì)纖維化;轉(zhuǎn)化生長因子-β1;siRNA;腺病毒;大鼠

目的:研究肺間質(zhì)纖維化大鼠肺組織中TGF-β1基因表達沉默對疾病進展的影響。方法:構(gòu)建TGF-β1腺病毒siRNA載體。75只大鼠隨機分為空白對照組15只，模型對照組、無關(guān)siRNA組和siRNA干預組各20只，后3組大鼠氣管內(nèi)滴入博萊霉素建立肺間質(zhì)纖維化模型，24 h后，空白對照組、模型對照組分別經(jīng)鼻滴入100 μL的生理鹽水，無關(guān)siRNA組、siRNA干預組分別滴入等體積的重組腺病毒pAdeno-X-siCon和pAdeno-X-siTGF。第7、14、28天，采用免疫組化法檢測肺組織TGF-β1蛋白的表達;第14天，采用Real-time PCR和Western blot分別檢測肺組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原及TGF-β1 mRNA和蛋白的表達;第7、14、28天，采用ELISA法檢測肺泡灌洗液和外周血中TGF-β1的表達水平。結(jié)果:第7、14、28天，4組大鼠肺組織中TGF-β1蛋白的表達和肺泡灌洗液中TGF-β1的水平差異均有統(tǒng)計學意義，第14天，4組大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原及TGF-β1 mRNA的表達差異亦有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)，且模型對照組、無關(guān)siRNA組和siRNA干預組以上指標均高于正常對照組，siRNA干預組以上指標低于模型對照組、無關(guān)siRNA組(P＜0.05)。結(jié)論:沉默TGF-β1對大鼠肺間質(zhì)纖維化的形成和發(fā)展可能有抑制作用。

肺間質(zhì)纖維化是多種原因引起的肺間質(zhì)的彌漫性疾病，大量的成纖維細胞增殖及細胞外基質(zhì)的聚集，導致彌散功能降低、通氣/血流比例失衡，最終呼吸衰竭而死亡［1］。近年，肺間質(zhì)纖維化的發(fā)病率有增加的趨勢［2］。目前，導致纖維化的機制尚未完全闡明，亦缺乏有效的方法延緩疾病的進展。有研究［3-4］證實轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的高表達與肺間質(zhì)纖維化的形成和發(fā)展有密切關(guān)系;TGF-β1是公認的“開關(guān)性”細胞因子［5-6］，抑制TGF-β1基因的表達有助于延緩肺間質(zhì)纖維化的疾病進展［7］。作者構(gòu)建了沉默TGF-β1基因表達的siRNA腺病毒，感染肺間質(zhì)纖維化大鼠，觀察沉默TGF-β1基因?qū)Υ笫蠓伍g質(zhì)纖維化疾病進展的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 穿梭質(zhì)粒pSIREN-Shuttle、腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeno-X(Clontech公司);內(nèi)切酶PI-SceⅠ、Ⅰ-CeuⅠ、BamHⅠ、HindⅢ、PacⅠ(New England BioLab公司);LipofectamineTM2000(Invitrogen公司);T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶(Promega公司);DNA Marker DL2000(上海佳和生物科技有限公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑、Real-time PCR試劑(TaKaRa公司);RNA提取、質(zhì)粒抽提和DNA膠回收試劑盒(QIAGEN公司);大鼠TGF-β1 ELISA檢測試劑盒(Bender公司);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司);SD雄性大鼠購自河南省實驗動物中心，實驗動物合格證號410116;博萊霉素(日本化藥株式會社)，批號Y91450;人胚腎細胞HEK293細胞(百恩維生物科技有限公司)。

1.2 重組RNA干擾腺病毒表達載體的構(gòu)建與包裝 依據(jù)GenBank中TGF-β1基因(NM_000660)的序列，使用Clontech公司的RNAi Designer軟件，設計出針對TGF-β1 siRNA的特異性靶序列和無關(guān)對照序列，兩端分別加入BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切殘基。針對TGF-β1 siRNA的特異性靶序列:siTGF上游引物 5’-GATCCGGGCAGCTGTACATTGACTTTT CAAGAGAAAGTCAATGTACAGCTGCCCTTTTTTG-3’，siTGF下游引物5’-AATTCAAAAAAGGGCAGCTG TACATTGACTTTCTCTTGAAAAGTCAATGTACAGCTG CCCG-3’，無關(guān)對照序列siCon上游引物5’-GATCC GTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGAC ACGTTCGGAGAATTCTTTTTTG-3’，siCon下游引物5’-AATTCAAAAAAGAATTCTCCGAACGTGTCACGTT CTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAACG-3’，寡核苷酸鏈由博尚公司合成。siTGF上、下游引物及si-Con上、下游引物的退火產(chǎn)物分別重組入pSIRENShuttle，得到pSIREN-Shuttle-siTGF和pSIREN-Shuttle-siCon。PI-SceⅠ/Ⅰ-CeuⅠ雙酶切pSIREN-Shuttle-siTGF和pSIREN-Shuttle-siCon得到siRNA單元(siTGF和siCon)，分別重組入腺病毒載體pAdeno-X，得到pAdeno-X-siTGF和pAdeno-X-siCon，DNA測序證實插入序列。PacⅠ酶切重組腺病毒質(zhì)粒pAdeno-X-siTGF和 pAdeno-X-siCon，用 LipofectamineTM2000將線性化的pAdeno-X-siTGF和pAdeno-X-si-Con轉(zhuǎn)染至70%～80%融合的HEK293細胞中，培養(yǎng)4～6 h，更換含血清的DMEM，24 h后觀察細胞形態(tài)變化。12～14 d后，當＞90%細胞出現(xiàn)病變時收集細胞，－80℃和37℃反復凍融3次，裂解細胞并收集病毒上清，用收集的上清重復感染HEK293細胞，擴增3～4次以提高腺病毒的滴度。純化、測定病毒滴度后保存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗分組、肺間質(zhì)纖維化模型制備及干預 雄性SD大鼠75只，體質(zhì)量(220±20)g，隨機分為空白對照組15只，模型對照組、無關(guān)siRNA組和siRNA干預組各20只;用體積分數(shù)10%的水合氯醛(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，無菌條件下做頸部正中切口，經(jīng)氣管軟骨環(huán)朝向心端插入注射器，模型對照組、無關(guān)siRNA組、siRNA干預組一次性緩慢注入博萊霉素0.2～0.3 mL制作肺間質(zhì)纖維化模型，空白對照組滴入等量的生理鹽水，縫合切口、常規(guī)消毒。24 h后，正常對照組、模型對照組分別經(jīng)鼻滴入100 μL的生理鹽水，無關(guān)siRNA組、siRNA干預組分別滴入等體積(含腺病毒1010pfu)的重組腺病毒pAdeno-X-siCon和 pAdeno-X-siTGF。分別于造模后第7、14、28天取材，每次各組處死5只，分別進行以下實驗。

1.4 肺組織病理形態(tài)學觀察及肺組織纖維化評分

將處死的大鼠無菌開胸，結(jié)扎右肺門，完整取下右肺，浸入體積分數(shù)4%的中性甲醛溶液中24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色，鏡下觀察。使用Ashcroft方法［8］評分。

1.5 肺組織中TGF-β1蛋白表達的檢測 取造模后第7、14、28天的右肺組織石蠟切片，行免疫組織化學SP染色，具體按照試劑盒說明書操作。兔抗人TGF-β1多克隆抗體按1∶150稀釋。TGF-β1蛋白陽性信號定位于胞質(zhì)，呈不同程度黃色顆粒狀物質(zhì)。以PBS代替一抗為陰性對照，以已知陽性的肝細胞癌組織為陽性對照。采用上海山富科學儀器有限公司的Biosen Digital Imaging System，取10個高倍視野，用陽性區(qū)平均灰度參數(shù)作為蛋白的相對表達量。

1.6 肺組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原及TGF-β1 mRNA表達的檢測 取造模后第14天大鼠左肺20～30 mg，提取總RNA，通用引物逆轉(zhuǎn)錄，使用Real-time PCR試劑擴增檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原及TGF-β1 mRNA的相對表達量，引物序列和擴增產(chǎn)物大小見表1。PCR反應條件:50℃ 30 min;94℃ 2 min，94℃ 40 s (TGF-β1為48℃30 s，Ⅰ型膠原為51℃ 30 s，Ⅲ型膠原為49℃30 s)，72℃1 min，共30個循環(huán);72℃延伸10 min。取5 μL反應產(chǎn)物行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上成像，進行灰度分析。

表1 RT-PCR引物

1.7 肺組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原及TGF-β1蛋白表達的檢測 采用Western blot法。另取造模后第14天左肺部分新鮮組織，迅速置于預冷的生理鹽水中，漂洗數(shù)次，按比例加入相應體積的裂解液進行勻漿，離心取上清，再加入相應體積的樣品緩沖液使蛋白變性，取上清，按試劑盒說明書操作。

1.8 肺泡灌洗液和外周血中TGF-β1的水平檢測取造模后第7、14、28天處死大鼠的剩余左肺，用磨鈍的9號腰穿針頭進入左主支氣管內(nèi)，用37℃無菌生理鹽水2 mL進行灌洗，并反復抽洗4次，至洗出液總量約6 mL，全部灌洗液混合后備用，檢測前搖勻。另取備用外周血，離心，取上清。按照ELISA試劑盒說明檢測肺泡灌洗液和外周血中TGF-β1的水平。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較同一時間點各組、同組別不同時間點大鼠肺組織纖維化程度、TGF-β1等指標的差異，兩兩比較采用 LSD-t檢驗。檢驗水準 α= 0.05。

2 結(jié)果

2.1 重組腺病毒表達載體的構(gòu)建 測序結(jié)果顯示測得的插入序列與設計的序列完全一致。pAdeno-X-siTGF和pAdeno-X-siCon包裝出腺病毒的滴度分別為8.21×1011和7.07×1011nfu/L。

2.2 各組大鼠的一般情況 空白對照組大鼠精神狀態(tài)好，活潑好動，食欲好，身體強壯，毛發(fā)光澤好，體質(zhì)量穩(wěn)定增加。模型對照組及無關(guān)siRNA組大鼠精神狀態(tài)差，活動明顯減少，食欲差，毛發(fā)無光澤。siRNA干預組大鼠的一般情況介于空白對照組和模型對照組之間，后期觀察時接近于空白對照組。整個實驗過程中，空白對照組未出現(xiàn)死亡，模型對照組于第23、25天死亡2只，無關(guān)siRNA組于第17、22、26天死亡3只，siRNA干預組于第26、27天死亡2只，剩余鼠數(shù)仍足以完成實驗。

2.3 肺組織病理形態(tài)學觀察及纖維化評分 空白對照組各觀察時間點肺組織結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯的肺泡間隔纖維化增厚等變化。模型對照組及無關(guān)siRNA組病變基本相似，第7天見肺泡間隔不均勻增厚，炎癥細胞浸潤;第14天見肺泡間隔明顯增厚，有纖維化區(qū)域;第28天見肺組織結(jié)構(gòu)基本消失，有大片融合的纖維化區(qū)域。siRNA干預組第7天見肺泡間隔增厚，接近模型對照組;第14天與28天見肺泡間隔增厚，有一定程度的纖維化，與模型對照組及無關(guān)siRNA組相比，病變程度減輕。大鼠肺組織病理學改變見圖1。肺組織纖維化程度評分見表2。

2.4 肺組織中TGF-β1蛋白的表達 TGF-β1蛋白陽性表達定位于胞質(zhì)，主要分布于支氣管黏膜上皮細胞、肺泡上皮細胞、肺泡巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞及成纖維細胞等。見圖2、表3。

2.5 肺組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原及TGF-β1的表達 見圖3、表4。

2.6 肺泡灌洗液和外周血中TGF-β1的水平 見表5、6。

圖1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)學比較(HE，×400)

表2 各組大鼠肺組織纖維化程度評分(n=5)

圖2 各組大鼠肺組織中TGF-β1蛋白的表達情況(SP，×400)

表3 各組大鼠肺組織中TGF-β1蛋白的表達(n=5) %

表4 第14天各組大鼠肺組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原及TGF-β1 mRNA的表達量(n=5)

圖3 第14天各組大鼠肺組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原及TGF-β1蛋白的表達

表5 各組大鼠肺泡灌洗液中TGF-β1的表達水平(n=5) μg/L

表6 各組大鼠外周血中TGF-β1的水平(n=5) μg/L

3 討論

肺間質(zhì)纖維化的病因目前尚未完全明確，細胞外基質(zhì)的聚積是其發(fā)生發(fā)展的原因之一，因此，抑制膠原的過多產(chǎn)生或促進其降解是延緩肺間質(zhì)纖維化進展的有效措施之一［7］。TGF-β1是迄今為止發(fā)現(xiàn)的細胞外基質(zhì)沉積最強的促進劑，且還能抑制膠原的降解，在肺間質(zhì)纖維化發(fā)病機制中的作用顯著［9-11］。因此，抑制TGF-β1的產(chǎn)生或阻斷其表達途徑是抑制肺間質(zhì)纖維化疾病進展的方法之一。

RNA干擾是通過被核酸切割開的小分子RNA (siRNA)與特異性蛋白結(jié)合形成RNA誘導沉默復合體，抑制蛋白質(zhì)的表達過程［12］，是在基因水平上治療疾病的重要方法。

目前，氣管內(nèi)滴入博萊霉素法是國內(nèi)外比較公認的造模方法［13］，造模后大鼠肺組織病理學符合肺間質(zhì)纖維化的病理改變。該研究中作者選用腺病毒作為載體，是因其與人類基因同源，對人致病性低，經(jīng)純化后病毒滴度高，不整合到染色體中，有嗜上皮性，對支氣管及肺泡上皮感染率高;實驗中采用滴鼻方式進行干預，可以有效提高局部藥物濃度并減輕全身毒副作用［14］。結(jié)果顯示，造模大鼠經(jīng)TGF-β1重組的siRNA腺病毒載體感染后，肺組織病理學變化較模型對照及無關(guān)siRNA組病情進展緩慢，至實驗后期，甚至有逆轉(zhuǎn)的趨勢，肺組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGF-β1 mRNA和蛋白的表達均低于模型對照組及無關(guān)siRNA組，肺泡灌洗液中TGF-β1的表達量亦是如此，因此，TGF-β1-siRNA對TGF-β1 mRNA基因的表達有一定的沉默作用，并對膠原的生成有一定的抑制作用;然而，外周血中各組間TGF-β1的水平無差異性，由此說明TGF-β1主要在肺組織中起作用，與既往研究結(jié)果一致，這可能為肺間質(zhì)纖維化的基因治療提供新的靶點。

綜上，沉默TGF-β1對大鼠肺間質(zhì)纖維化的形成和發(fā)展可能有抑制作用。該研究為將來臨床上應用基因沉默方法治療肺間質(zhì)纖維化提供了一定的實驗基礎(chǔ)。

［1］Subbiah R，Michelle V，Sekhar PR，et al.Fra-1/AP-1 transcription factor negatively regulates pulmonary fibrosis in vivo［J］.PLoS One，2012，7(7):e41611

［2］Wang WJ，Liao B，Zeng M，et al.The effects of aerosolized STAT1 antisense oligodeoxynucleotides on rat pulmonary fibrosis［J］.Cell Mol Immunol，2009，6(1):51

［3］Li XX，Li N，Ban CJ，et al.Idiopathic pulmonary fibrosis in relation to gene polymorphisms of transforming growth factor-β1 and plasminogen activator inhibitor 1［J］.Chin Med J(Engl)，2011，124(13):1923

［4］Sueblinvong V，Neujahr DC，Mills ST，et al.Predisposition for disrepair in the aged lung［J］.Am J Med Sci，2012，344 (1):41

［5］Sureshbabu A，Tonner E，Allan GJ，et al.Relative roles of TGF-β and IGFBP-5 in idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Pulm Med，2011，2011:517687

［6］Kolosova I，Nethery D，Kern JA.Role of Smad2/3 and p38 MAP kinase in TGF-β1-induced epithelial-mesenchymal transition of pulmonary epithelial cells［J］.J Cell Physiol，2011，226(5):1248

［7］Ley B，Collard HR，King TE Jr.Clinical course and prediction of survival in idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Am J Respir Crit Care Med，2011，183(4):431

［8］ Wynn TA.Integrating mechanisms of pulmonary fibrosis［J］.J Exp Med，2011，208(7):1339

［9］Wilkins-Port CE，Ye Q，Mazurkiewicz JE，et al.TGF-β1+ EGF-initiated invasive potential in transformed human keratinocytes is coupled to a plasmin/MMP-10/MMP-1-dependent collagen remodeling axis:role for PAI-1［J］.Cancer Res，2009，69(9):4081

［10］Douglas HE.TGF-β in wound healing:a review［J］.J Wound Care，2010，19(9):403

［11］陳沖，封志純.支氣管肺發(fā)育不良分子遺傳學研究進展［J］.實用兒科臨床雜志，2012，27(16):1282

［12］Dang Y，Yang Q，Xue Z，et al.RNA interference in fungi: pathways，functions，and applications［J］.Eukaryot Cell，2011，10(9):1148

［13］Moeller A，Ask K，Warburton D，et al.The bleomycin animal model:a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis?［J］.Int J Biochem Cell Biol，2008，40(3):362

［14］Bartram U，Speer CP.The role of transforming growth factor beta in lung development and disease［J］.Chest，2004，125 (2):754

Effects of TGF-β1 silencing by adenovirus siRNA on expression of TGF-β1 and content of collagenⅠandⅢin rat with pulmonary interstitial fibrosis

LIU Shaoxia1)，ZHANG Liying1)，ZHAO Guoqiang2)，ZHANG Guojun1)1)Department of Respiratory Medicine，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052 2)Department of Microbiology and Immunology，College of Medical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001

pulmonary interstitial fibrosis;TGF-β1;siRNA;adenovirus;rat

Aim:To study the influence of silencing TGF-β1 gene expression in rats with pulmonary interstitial fibrosis (PIF)on the progress of the disease.Methods:The siRNA adenovirus vector was constructed and wrapped as adenovirus particle.A total of 75 rats were randomly allocated into blank control group(n=15)，model control group(n=20)，siRNA-irrelevant group(n=20)and siRNA intervention group(n=20).The rat model with PIF was established in the latter 3 groups.After 24 h，the siRNA-irrelevant group and siRNA intervention group were given pAdeno-X-siCon and pAdeno-X-siTGF，respectively.On the 7th，14th，and 28th day，the expression of TGF-β1 protein in lung tissue was detected by immunohistochemical method;on the 14th day，the mRNA and protein expressions of collagenⅠandⅢ，and TGF-β1 in lung tissue were detected by Real-time PCR and Western blot;on the 7th，14th，and 28th day，the level of TGF-β1 in the bronchus alveolus lavage fluid and the peripheral blood was detected by ELISA.Results:On the 7th，14th，and 28th day，the expression of TGF-β1 protein in lung tissue and the level of TGF-β1 in the bronchus alveolus lavage fluid among the 4 groups had significant difference;on the 14th day，the expressions of collagenⅠ andⅢ，TGF-β1 mRNA in the lung tissue of the 4groups also had significant difference(P＜0.05)，among which，the above parameters in the model control group，siRNA-irrelevant group and siRNA intervention group were all higher than the blank control group，and those in the siRNA intervention group were lower than the model control group and siRNA-irrelevant group(P＜0.05).Conclusion:Silencing TGF-β1 may inhibit the formation and development of PIF in rats.

R563.9

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.012

*河南省杰出青年支持基金資助項目 094100510014

(2011-11-30收稿 責任編輯徐春燕)