王 鵬，任鵬飛，代麗萍，王凱娟，張建營#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室鄭州 450001 2)河南省腫瘤流行病學(xué)重點實驗室鄭州 450052 #通訊作者，男，1962年10月生，博士，教授，研究方向:腫瘤流行病學(xué)，E-mail:jianyingzhang@hotmail.com

重組α2-HS糖蛋白的原核表達、純化及免疫學(xué)活性分析*

王 鵬1，2)，任鵬飛1)，代麗萍1，2)，王凱娟1，2)，張建營1，2)#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室鄭州 450001 2)河南省腫瘤流行病學(xué)重點實驗室鄭州 450052 #通訊作者，男，1962年10月生，博士，教授，研究方向:腫瘤流行病學(xué)，E-mail:jianyingzhang@hotmail.com

α2-HS糖蛋白;原核表達;蛋白純化;抗原性

目的:原核表達并純化具有生物學(xué)活性的重組α2-HS糖蛋白(AHSG)。方法:提取人肝癌細胞株HepG2細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，PCR擴增出目的基因，與pMD18-T載體連接后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，大量擴增后提取克隆質(zhì)粒，連接至原核表達載體pEP-30a(+)中，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)蛋白表達，通過鎳離子親和層析的方法純化重組蛋白，采用SDS-PAGE電泳、免疫印跡雜交法對純化產(chǎn)物進行分析鑒定。結(jié)果:成功構(gòu)建了AHSG原核表達系統(tǒng)BL21(pET30a-AHSG)，最佳誘導(dǎo)條件為80 μmol/L IPTG誘導(dǎo)3 h;誘導(dǎo)表達的蛋白相對分子質(zhì)量約54 600，主要以不溶性的包涵體形式存在，純化后的重組蛋白質(zhì)量濃度最高達2.3 g/L，經(jīng)免疫印跡雜交鑒定有抗原性。結(jié)論:成功構(gòu)建了AHSG原核表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)可高效表達重組AHSG蛋白，該蛋白具有良好的抗原性。

α2-HS糖蛋白(alpha2-Heremans-Schmid glycoprotein，AHSG)是一種存在于人體血清中的糖蛋白。目前的研究［1-6］顯示，AHSG與多種腫瘤關(guān)系密切，在腫瘤患者體內(nèi)異常表達，是一種腫瘤相關(guān)抗原，有可能成為診斷腫瘤的一種血清學(xué)標(biāo)志物。作者嘗試應(yīng)用大腸桿菌原核系統(tǒng)表達AHSG基因并對表達產(chǎn)物進行純化，以獲得大量的AHSG蛋白，為后續(xù)的AHSG作為一種血清學(xué)標(biāo)志物在腫瘤早期診斷中的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 凝膠回收試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;Taq酶購自上海Promega公司; EcoRⅠ、SalⅠ、dNTP及T4 DNA連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司;兔源AHSG多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG均購自美國Gene Tex公司。

1.2 菌株與質(zhì)粒 肝癌細胞株HepG2、克隆質(zhì)粒pMD18-T和表達質(zhì)粒pET-30a(+)均為該研究室保存;大腸桿菌DH5α購自大連寶生物工程公司;大腸桿菌BL21(DE3)購自天根生化科技有限公司。

1.3 AHSG基因的擴增 根據(jù)Genbank中AHSG基因的cDNA序列，設(shè)計其PCR引物如下:上游5’-CGGAATTCATGAAGTCCCTCGTCCTGCTC-3’(EcoRⅠ)，下游5’-CGGGTCGACCTAGACCTTGAAGTGT CTGAT-3’(SalⅠ)，產(chǎn)物大小1 104 bp。按照試劑盒說明提取HepG2總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA;以cDNA為模板進行PCR，反應(yīng)體系50 μL，包括10× Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，MgCl23 μL，上、下游引物各0.75 μL，Taq酶0.5 μL，模版cDNA 3.3 μL，滅菌超純水32.7 μL。PCR循環(huán)條件:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，70℃退火30 s，以后每個循環(huán)降1.5℃，72℃延伸30 s，共20個循環(huán);94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸70 s，共20個循環(huán);最后72℃延伸10 min。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物于8 g/L瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像進行分析。

1.4 克隆質(zhì)粒AHSG-T的構(gòu)建及鑒定 按照膠回收試劑盒說明回收AHSG基因的PCR產(chǎn)物，在T4 DNA連接酶作用下，與pMD18-T連接;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆。對陽性克隆進行EcoRⅠ單酶切和EcoRⅠ與SalⅠ雙酶切鑒定、特異PCR鑒定，以初步確定克隆質(zhì)粒AHSG-T構(gòu)建的正確性。然后對克隆質(zhì)粒進行測序，陽性克隆采用通用引物M13測序，測序結(jié)果采用NCBI網(wǎng)上序列分析軟件進行cDNA序列和氨基酸序列同源性分析。

1.5 重組表達質(zhì)粒pET-30a-AHSG的構(gòu)建及鑒定克隆質(zhì)粒AHSG-T與表達載體pET-30a(+)均經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切，凝膠回收AHSG DNA片段和pET-30a線性片段，在T4 DNA連接酶作用下連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-30a-AHSG，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，酶切及特異PCR擴增鑒定。

1.6 AHSG重組蛋白的誘導(dǎo)表達及純化 從轉(zhuǎn)化成功的DH5α重組菌中使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞BL21(DE3)，以構(gòu)建原核表達系統(tǒng)BL21(pET-30a-AHSG)。使用不同濃度的IPTG(30、80、300、800和1 200 μmol/L)誘導(dǎo)BL21(pET-30a-AHSG)3 h，以未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pET-30a(+)的BL21(DE3)作為空白對照，行SDSPAGE，測定誘導(dǎo)產(chǎn)物中目的蛋白的濃度。以最佳IPTG濃度誘導(dǎo) BL21(pET-30a-AHSG)不同時間(0.5、1、2、3、4和5 h)，行SDS-PAGE，測定誘導(dǎo)產(chǎn)物中目的蛋白的濃度，以確定最佳誘導(dǎo)時間。在優(yōu)化后的誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)BL21(pET-30a-AHSG)，分析目的蛋白在細胞內(nèi)的定位，即可溶性分析。在優(yōu)化后的誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)4 L BL21(pET-30a-AHSG)，采用鎳離子親和層析的方法純化帶有組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白，紫外分析法測定純化蛋白的質(zhì)量濃度。

1.7 AHSG重組蛋白的免疫學(xué)活性分析 取10 μL質(zhì)量濃度最高管中的AHSG純化蛋白行SDSPAGE，卸膠后使用濕轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)移目的蛋白到硝酸纖維素(NC)膜上，采用恒流模式，電流強度0.02 A，轉(zhuǎn)膜時間110 min，轉(zhuǎn)膜后麗春紅染膜，判斷轉(zhuǎn)膜效果。將NC膜浸入封閉液中封閉2 h，與一抗(兔源AHSG多克隆抗體)室溫孵育2 h，與二抗(HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG)室溫孵育1 h，DAB顯色。

2 結(jié)果

2.1 AHSG基因的RT-PCR擴增結(jié)果 擴增產(chǎn)物中高亮度的DNA片段長度為1 104 bp，與AHSG基因的cDNA長度一致，見圖1。

圖1 AHSG基因RT-PCR擴增結(jié)果

2.2 克隆質(zhì)粒AHSG-T鑒定結(jié)果 見圖2。AHSG-T的單酶切和雙酶切產(chǎn)物均出現(xiàn)長度約為2 700 bp和1 104 bp的兩條片段(與pMD18-T載體和AHSG基因的長度一致)，特異PCR擴增產(chǎn)物中存在1 104 bp片段，證實克隆質(zhì)粒AHSG-T構(gòu)建成功。

圖2 克隆質(zhì)粒AHSG-T的鑒定

同源性分析結(jié)果顯示，擴增出的AHSG基因與NCBI網(wǎng)上GENE ID197的基因有7個核苷酸差異，同源性為99%;該基因編碼367個氨基酸，與AHSG (NP_001613.2)有4個氨基酸差異，分別為第248位蘇氨酸→甲硫氨酸，第256位蘇氨酸→絲氨酸，第267位蘇氨酸→丙氨酸，第358位酪氨酸→半胱氨酸，同源性為98.9%。

2.3 重組表達質(zhì)粒pET-30a-AHSG的鑒定結(jié)果見圖3。pET-30a-AHSG單、雙酶切均獲得2條分別與pET-30a(+)和AHSG基因長度一致的條帶，特異PCR擴增得到約1 100 bp的基因片段，證明成功構(gòu)建了含有AHSG基因的重組表達質(zhì)粒。

圖3 重組表達質(zhì)粒pET-30a-AHSG的鑒定

2.4 原核表達系統(tǒng)BL21(pET-30a-AHSG)誘導(dǎo)條件優(yōu)選結(jié)果

2.4.1 最佳誘導(dǎo)濃度 不同濃度IPTG均可誘導(dǎo)目的蛋白的表達，目的蛋白的表達量差異不明顯，80 μmol/L IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)物中的目的蛋白表達量稍大(圖4)，故選擇80 μmmol/L IPTG作為最佳誘導(dǎo)劑濃度。

圖4 不同濃度IPTG誘導(dǎo)3 h后目的蛋白的表達

2.4.2 最佳誘導(dǎo)時間 誘導(dǎo)1～5 h樣品均可觀察到目的蛋白條帶(圖5)，但表達量無明顯差異。選擇3 h作為最佳誘導(dǎo)時間。

圖5 80 μmol/L IPTG誘導(dǎo)不同時間后目的蛋白的表達

2.5 重組蛋白AHSG分析

2.5.1 AHSG重組蛋白的可溶性分析 結(jié)果見圖6。可見目的蛋白在裂解上清中所占的比例很小，主要以不溶性的包涵體形式存在。

圖6 重組蛋白AHSG在細胞內(nèi)的定位分析

2.5.2 AHSG重組蛋白的純化結(jié)果 SDS-PAGE結(jié)果見圖7。測得的蛋白質(zhì)量濃度最大達到2.3 g/L。

圖7 AHSG重組蛋白的純化結(jié)果

2.5.3 純化蛋白的免疫學(xué)活性分析 免疫印跡雜交結(jié)果見圖8?？梢?，重組蛋白可以與AHSG抗體發(fā)生特異性結(jié)合，證明重組蛋白具有AHSG抗原性。

圖8 純化蛋白的Western blot鑒定

3 討論

AHSG是一種存在于健康人體血清中具有高度遺傳多態(tài)性的糖蛋白，由349個氨基酸殘基編碼兩條多肽鏈組成，主要由肝臟合成，后儲存、富集于骨組織中。其基因染色體定位于3q27，由7個外顯子組成，橫跨8.2 kb基因組DNA，cDNA長度為1 104 bp，有AHSG1、AHSG2兩個等位基因，在等電聚焦中展現(xiàn)其多態(tài)性，和PP63屬于同源基因。

AHSG具有多種生物功能:①與胎兒大腦皮質(zhì)的發(fā)育有關(guān)，在胎兒期腦脊液中高濃度表達［7］。②作為一個全身性的堿性磷酸鈣阻止器，參與骨基質(zhì)的形成和重組［8］。③作為一種天然的胰島素酪氨酸激酶受體抑制劑，其血清水平與胰島素抵抗水平有關(guān)。④可阻斷轉(zhuǎn)化生長因子和細胞表面受體的結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)化生長因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并可阻止TGF-β誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)換，在腫瘤進程中發(fā)揮作用。⑤在一些血液系統(tǒng)惡性疾病和實體瘤中含量減少。

目前，對AHSG基因的研究較多側(cè)重于其與糖尿病、子宮內(nèi)膜癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤及骨密度的關(guān)系［9］，有關(guān)AHSG基因與腸道腫瘤、肺癌、乳癌、肝癌等惡性腫瘤的關(guān)系的研究也有報道［3-6］，提示AHSG可作為惡性腫瘤的一種血清學(xué)標(biāo)志物用于腫瘤的診斷。作者采用基因工程方法，對AHSG進行了克隆、重組表達并純化，得到了較純的AHSG融合蛋白，為進一步評價AHSG在常見腫瘤診斷中的價值奠定了基礎(chǔ)。

［1］Mathews ST，Deutsch DD，Iyer G，et al.Plasma alpha2-HS glycoprotein concentrations in patients with acute myocardial infarction quantified by a modified ELISA［J］.Clin Chim Acta，2002，319(1):27

［2］陳學(xué)彬.人腦膠質(zhì)瘤AHSG的相關(guān)性研究進展［D］.蘇州:蘇州大學(xué)，2006.

［3］Swallow CJ，Partridge EA，Macmillan JC，et al.α2 HS-glycoprotein，an antagonist of transforming growth factor β in vivo，inhibits intestinal tumor progression［J］.Cancer Res，2004，64(18):6402

［4］劉彥.人肺鱗癌相關(guān)差異表達基因和基因表達譜的研究［D］.北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，2007.

［5］Yi JK，Chang JW，Han W，et al.Autoantibody to tumor antigen，alpha 2-HS glycoprotein:a novel biomarker of breast cancer screening and diagnosis［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2009，18(5):1357

［6］聶軼飛，王凱娟，代麗萍，等.肝癌相關(guān)抗原血清學(xué)自身抗體反應(yīng)分析［J］.中國公共衛(wèi)生，2007，123(7):801

［7］Deng HW，Xu FH，Davies KM，et al.Differences in bone mineral density，bone mineral content，and bone areal size in fracturing and non-fracturing women，and their interrelationships at the spine and hip［J］.J Bone Miner Metab，2002，20(6):358

［8］Szweras M，Liu D，Partridge EA，et al.Alpha2-HS glycoprotein/fetuin，a transforming growth factor-beta/bone morphogenetic protein antagonist，regulates postnatal bone growth and remodeling［J］.J Biol Chem，2002，277(22): 19991

［9］Kalaby L，Cseh K，Pajor A，et al.Correlation of maternal serum fetuim/alpha 2-HS-glycoprotein concentration with maternal insulin resistance and anthropometric parameters of neonates in normal pregnancy and gestational diabetes［J］.Eur J Endocrinol，2002，147(2):243

Prokaryotic expression，purification and immunological analysis of recombinant alpha2-Heremans-Schmid glycoprotein

WANG Peng1，2)，REN Pengfei1)，DAI Liping1，2)，WANG Kaijuan1，2)，ZHANG Jianying1，2)1)Department of Epidemiology，College of Public Health，Zhengzhou University，Zhengzhou 4500012)Henan Key Laboratory of Tumor Epidemiology，Zhengzhou 450052

alpha2-Heremans-Schmid glycoprotein;prokaryotic expression;protein purification;antigenicity

Aim:To express and purify recombinant alpha2-Heremans-Schmid glycoprotein(AHSG)with biological activity.Methods:The total RNA from HepG2 cells was extracted and cDNA was synthesized.AHSG gene was amplified by RT-PCR method，then cloned on pMD18-T vector.The constructed clone plasmid was transformed into E.coli DH5α，then the fragments of AHSG acquired from that were ligated with pET-30a(+)vector.The recombinant AHSG protein was expressed after the constructed expression plamid was tranformed into E.coli BL21(DE3)and purified by Nickel ion affinity chromatography.The purified products were identified and analyzed by SDS-PAGE and Western blot，and the concentration of purified protein was measured.Results:The prokaryotic expression system BL21(pET30a-AHSG)was constructed successfully.The most appropriate condition for the expression of target protein was 80 μmol/L IPTG for 3 h.A fusion protein approximately 54 600 was yielded，mainly existing in the form of insoluble inclusion bodies.The highest concentration of recombinant protein purified by Nickel ion affinity chromatography was up to 2.3 g/L.The recombinant protein had antigenicity identified by Western blot.Conclusion:The prokaryotic expression system of AHSG and protein purification system have been successfully constructed and the purified AHSG recombinant protein is highly antigenic and immunogenic.

Q789

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.01.003

*國家自然科學(xué)基金面上項目資助 30872962

(2011-07-03收稿 責(zé)任編輯王 曼)