張 田，魏子峰，秦麗娟，周洪霞，張宇新

（1.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，河北 唐山063000；2.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，河北 唐山063000）

羅格列酮對帕金森病模型小鼠中腦黑質(zhì)iNOS和IL－6表達(dá)的抑制作用及其意義

張 田1，魏子峰2，秦麗娟1，周洪霞2，張宇新2

（1.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，河北 唐山063000；2.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，河北 唐山063000）

目的：探討羅格列酮對帕金森?。≒D）模型小鼠中腦黑質(zhì)中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和白細(xì)胞介素－6（IL－6）的調(diào)控作用，并闡明其機(jī)制。方法：45只雄性小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和羅格列酮處理組，每組15只。采用爬桿實(shí)驗(yàn)法觀察各組小鼠行為學(xué)變化；采用免疫組織化學(xué)染色和Western blotting法觀察小鼠中腦黑質(zhì)酪氨酸羥化酶（TH）、iNOS和IL－6的表達(dá)。結(jié)果：模型組小鼠出現(xiàn)震顫、步態(tài)遲緩等PD樣癥狀；小鼠轉(zhuǎn)身（T－turn）及爬桿時(shí)間（T－LA）較對照組顯著延長（P＜0.05）；黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元缺失，炎癥因子iNOS和IL－6陽性細(xì)胞明顯增多，蛋白表達(dá)水平高于對照組（P＜0.05）；羅格列酮處理組小鼠PD樣癥狀較模型組減輕，T－turn和T－LA少于模型組（P＜0.05），iNOS、IL－6和TH陽性細(xì)胞數(shù)及蛋白表達(dá)水平與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：羅格列酮可能通過抑制炎癥因子iNOS和IL－6表達(dá)，對多巴胺能神經(jīng)元起到保護(hù)作用。

帕金森??；酪氨酸羥化酶；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；白細(xì)胞介素－6；羅格列酮

目前，帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）的治療多采用多巴胺（dopamine，DA）替代療法，但DA替代療法只能起到改善癥狀的作用，不能延緩疾病進(jìn)程和多巴胺能神經(jīng)元退變，長期應(yīng)用DA可能會導(dǎo)致疾病惡化，因此急需找到其他有效的治療藥物。近年研究［1－2］顯示：神經(jīng)炎癥可能是導(dǎo)致PD多巴胺能神經(jīng)元丟失的重要因素，炎癥因子引起了多巴胺能神經(jīng)元變性丟失，因此抗炎治療可能成為PD的重要治療策略之一。羅格列酮是一種常用的治療糖尿病藥物，文獻(xiàn)［3］報(bào)道：其在神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病中對神經(jīng)元有保護(hù)作用，而羅格列酮對PD是否有治療作用目前國內(nèi)外尚無報(bào)道。為明確這一問題，本實(shí)驗(yàn)以1－甲基－4－苯基－1，2，3，6四氫吡啶（1－methyl－4－phenyl－1，2，3，6－tetrahyd － ropyridine，MPTP）制備PD小鼠模型，探討羅格列酮能否可以減少PD模型小鼠黑質(zhì)中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和白細(xì)胞介素－6（interleukin－6，IL－6）的表達(dá)，從而對多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用，以期為PD的治療尋找新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑 45只雄性健康C57BL／6N小鼠，12～14周齡，體質(zhì)量25～30 g，清潔級，購于北京維通利華公司［SCXX（京）2002－2003］，小鼠均自由進(jìn)食、飲水，在室溫（25±2）°C單籠喂養(yǎng)。MPTP（Sigma公司，USA）；兔抗鼠iNOS單克隆抗體、UltraSensitive SP超敏試劑盒（福州邁新公司，中國）；兔抗大鼠IL－6單克隆抗體（Eptomics公司，USA）；預(yù)染蛋白 Marker（天津?yàn)笊锕?，中國）；大鼠抗TH單克隆抗體（Chemicon公司，USA）；羅格列酮（葛蘭素史克公司，英國）。

1.2 動物分組及給藥 小鼠隨機(jī)分為模型組、羅格列酮處理組和對照組，每組15只。模型組：小鼠腹腔注射 MPTP（25 mg·kg－1，生理鹽水溶解），每天1次，連續(xù)7 d；羅格列酮處理組：在MPTP注射前4 h給予小鼠羅格列酮灌胃預(yù)處理（4 mg·kg－1），每天1次，連續(xù)7 d；對照組：注射與模型組小鼠等量的生理鹽水。

1.3 組織固定、取材和切片 MPTP第7次注射后12 h，每組隨機(jī)取9只小鼠。小鼠腹腔麻醉后，經(jīng)左心室插管用生理鹽水（室溫）灌注，再用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液緩慢灌注固定，迅速切取小鼠中腦黑質(zhì)部位腦塊，置于4%多聚甲醛中固定48 h（4°C），固定好的腦組織經(jīng)蒸餾水沖洗、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟和包埋處理，石蠟切片機(jī)做連續(xù)冠狀切片，片厚5 m，4°C保存?zhèn)溆?。每組15只小鼠中，隨機(jī)取6只進(jìn)行Western blotting分析。小鼠麻醉后，迅速斷頭取腦，分離小鼠中腦黑質(zhì)部分，置入細(xì)胞裂解液中，低溫勻漿，4°C震蕩30 min后，12000 min－1、4°C離心15 min，取上清液，－80°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 小鼠行為學(xué)檢測 采用爬桿實(shí)驗(yàn)測定各組小鼠行為學(xué)改變。在MPTP注射7 d后，將1根長55.0 cm、直徑0.8 cm的木桿上端纏以紗布以防止打滑，作為實(shí)驗(yàn)爬桿。測試時(shí)將被測小鼠頭向上置于木桿頂端，分別記錄小鼠轉(zhuǎn)身時(shí)間（T－turn）和完全爬到桿底所需要的時(shí)間（T－LA）。每只小鼠測3次，取平均值。爬桿時(shí)間參數(shù)延長反應(yīng)小鼠運(yùn)動功能損害的程度。

1.5 免疫組織化學(xué)SP法檢測各組小鼠酪氨酸羥化酶（TH）、iNOS和IL－6陽性神經(jīng)元數(shù)量 切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，用TBS緩沖液p H（7.4±0.2）洗3次，每次5 min；組織切片進(jìn)行水浴法抗原修復(fù)；降至室溫；每張切片加入過氧化氫25μL，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；每張切片滴加10%正常山羊血清25μL，室溫孵育15 min，同一組織相鄰切片分別加入兔抗鼠iNOS單克隆抗體（1∶150）、兔抗大鼠IL－6單克隆抗體（1∶150）和大鼠抗TH單克隆抗體（1∶300），4°C過夜；加入二抗（生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，1∶150），室溫孵育20 min；加入鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化酶溶液25μL，室溫孵育20 min，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。用多巴胺能神經(jīng)元特異性標(biāo)志酶TH判定模型小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元變化以及炎癥因子iNOS和IL－6的表達(dá)變化。采用CMIAS真彩醫(yī)學(xué)圖像自動分析系統(tǒng)進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。各組每只動物取3張腦片，數(shù)值相加后取平均值。

1.6 免疫熒光組織化學(xué)染色法觀察各組小鼠TH、iNOS和IL－6的表達(dá)部位 腦組織切片常規(guī)脫蠟至水后，PBS洗3次，每次15 min，正常非免疫動物血清室溫孵育30 min，同一組織相鄰切片分別加入兔抗鼠iNOS單克隆抗體（1∶100）與小鼠抗人TH單克隆抗體（1∶300）的一抗混合液和小鼠抗人TH單克隆抗體（1∶300）與兔抗大鼠IL－6單克隆抗體（Ser63，1∶100）的一抗混合液，4℃過夜，PBS振洗3次，每次15 min，加入異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶60）和四甲基若丹明異硫氰酸鹽（tetramethyl rhodamine isothiocyanate，TRITC）標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1∶100）熒光二抗混合液，37℃、60 min，PBS振洗3次，每次15 min，雙蒸水振洗10 min，甘油緩沖液封片，熒光顯微鏡觀察照相。綠色熒光為iNOS和IL－6表達(dá)，紅色熒光為TH表達(dá)，橘黃色為雙重?zé)晒馊旧?/p>

1.7 Western blotting法檢測各組小鼠 TH、iNOS和IL－6蛋白表達(dá)量 蛋白定量后取4倍體積樣品緩沖液，95℃變性10 min。蛋白上樣量為每孔30 g，10%SDS－PAGE電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，依相對分子質(zhì)量大小切取條帶，加入封閉液，室溫下震蕩2 h后，取相應(yīng)條帶分別加入兔抗鼠iNOS單克隆抗體（1∶300）、兔抗大鼠IL－6單克隆抗體（1∶200）和大鼠抗TH單克隆抗體（1∶400），4℃過夜。室溫孵育1 h后分別加入二抗（生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，1∶500），室溫孵育1 h；加入鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化酶溶液室溫下孵育0.5 h；DAB顯色，掃描蛋白印跡條帶，作定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各組小鼠T－turn、T－LA、小鼠中腦黑質(zhì)iNOS、IL－6和TH陽性細(xì)胞數(shù)及蛋白表達(dá)量以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 3組小鼠行為學(xué)表現(xiàn) MPTP注射7 d后，模型組小鼠出現(xiàn)典型PD樣癥狀，表現(xiàn)為豎毛、翹尾、震顫和運(yùn)動變緩等特征。爬桿實(shí)驗(yàn)中，與對照組小鼠比較，模型組小鼠出現(xiàn)爬桿能力下降，爬桿所需時(shí)間顯著延長。羅格列酮處理后，小鼠運(yùn)動功能得到一定程度改善，表現(xiàn)為爬桿時(shí)間明顯縮短。見表1。

表1 3組小鼠轉(zhuǎn)身時(shí)間和爬桿時(shí)間的比較Tab.1 Comparisons the time of T－turn and T－LA between various groups （n＝9，±s，t／s）

表1 3組小鼠轉(zhuǎn)身時(shí)間和爬桿時(shí)間的比較Tab.1 Comparisons the time of T－turn and T－LA between various groups （n＝9，±s，t／s）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group.

Group T－turn T－LA Control 2.2±0.6 5.3±1.5 Model 4.9±1.3＊ 13.8±3.7＊Rosiglitazone 3.1±0.9△ 7.7±2.8△

2.2 iNOS、IL－6和TH免疫熒光雙重染色 模型組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)可見TH免疫熒光單標(biāo)記細(xì)胞為紅色（圖1 A和B，見插頁二），iNOS和IL－6免疫熒光單標(biāo)記細(xì)胞為綠色（圖1 C和D，見插頁二），融合圖像可見橘黃色熒光，表明iNOS和IL－6與TH有部分共定位（圖1 E和F，見插頁二），黑質(zhì)區(qū)大多數(shù)表達(dá)iNOS和IL－6的神經(jīng)元均為多巴胺能神經(jīng)元。

2.3 3組小鼠iNOS、IL－6和TH陽性細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量 對照組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)偶見iNOS和IL－6陽性細(xì)胞，第7次注射MPTP后12 h模型組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)iNOS和IL－6陽性細(xì)胞顯著增多，胞質(zhì)呈棕黃色；羅格列酮處理組iNOS和IL－6陽性細(xì)胞較模型組減少。圖像分析，模型組和羅格列酮處理組iNOS和IL－6陽性細(xì)胞數(shù)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2（插頁三）和表2。對照組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元排列整齊密集，與對照組比較，模型組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元大量丟失，羅格列酮處理組TH陽性神經(jīng)元丟失程度明顯減輕。模型組和羅格列酮處理組TH陽性細(xì)胞數(shù)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3（插頁三）和表2。

2.4 3組小鼠IL－6、iNOS和TH蛋白表達(dá)水平免疫印跡，對照組小鼠中僅有微量IL－6、iNOS蛋白表達(dá)，模型組小鼠中IL－6、iNOS表達(dá)水平較對照組顯著升高（P＜0.05）；羅格列酮處理組IL－6、iNOS蛋白表達(dá)水平較模型組明顯下降（P＜0.05）；模型組 TH 表達(dá)較對 照組降低（P＜0.05），模型組和羅格列酮處理組TH表達(dá)量比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而羅格列酮處理組與對照組IL－6、iNOS和TH表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4和表3。

表2 3組小鼠中腦黑質(zhì)iNOS、IL－6和TH陽性細(xì)胞數(shù)Tab.2 The numbers of iNOS，IL－6 and TH positive cells in the substantia nigra of the midbrain of mice in three groups（n＝9，±s）

表2 3組小鼠中腦黑質(zhì)iNOS、IL－6和TH陽性細(xì)胞數(shù)Tab.2 The numbers of iNOS，IL－6 and TH positive cells in the substantia nigra of the midbrain of mice in three groups（n＝9，±s）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group.

Group iNOS IL－6 TH Control 1.45±0.541.33±0.29140.29±8.75 Model 37.35±6.43＊ 36.45±4.70＊ 85.21±6.31＊Rosiglitazone 8.43±1.19△ 9.13±1.69△ 117.43±7.33△

圖4 3組小鼠中腦黑質(zhì)IL－6、iNOS和TH蛋白表達(dá)電泳圖Fig.4 Electrophoregram of expressions of IL－6，iNOS and TH in the substantia nigra of the midbrain of mice in three groups

表3 3組小鼠中腦黑質(zhì)IL－6、iNOS和TH蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of IL－6，iNOS and TH in the substantia nigra of the midbrain of mice in three groups（n＝9，±s）

表3 3組小鼠中腦黑質(zhì)IL－6、iNOS和TH蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of IL－6，iNOS and TH in the substantia nigra of the midbrain of mice in three groups（n＝9，±s）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group.

Group IL－6 iNOS TH Control 4.24±0.282.17±0.2419.78±3.13 Model 26.33±3.01＊ 25.32±3.98＊ 11.89±1.47＊Rosiglitazone 7.28±1.42△ 9.10±1.35△ 16.14±1.32△

3 討 論

PD是一種常見于中老年人中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退變性疾病，主要病理特征為黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性丟失，使黑質(zhì)－紋狀體通路DA釋放減少，從而出現(xiàn)靜止性震顫、肌肉強(qiáng)直和運(yùn)動遲緩等臨床癥狀。盡管目前PD的發(fā)病機(jī)制仍不是十分清楚，但越來越多的證據(jù)［4］表明：炎癥反應(yīng)可能在PD 發(fā)病中起重要作用。研究［5－7］顯示：應(yīng)用MPTP、6－羥 多 巴 胺（6－h(huán)ydroxydopamine，6－OHDA）和魚藤酮建立PD動物模型，能顯著刺激炎癥因子如iNOS和IL－6的表達(dá)，造成多巴胺能神經(jīng)元變性丟失。國外學(xué)者研究［8］發(fā)現(xiàn)：在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立的PD體外模型中，抑制iNOS和IL－6表達(dá)，可對多巴胺能神經(jīng)元起到保護(hù)作用。另有研究［9］顯示：PD患者中腦黑質(zhì)區(qū)變性神經(jīng)元周圍炎癥因子水平顯著升高。本實(shí)驗(yàn)采用MPTP制備PD小鼠模型，于MPTP注射后第7天觀察小鼠黑質(zhì)區(qū)炎癥因子iNOS和IL－6蛋白表達(dá)和TH神經(jīng)元丟失情況，結(jié)果顯示：模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元丟失明顯，同時(shí)伴有炎癥因子iNOS和IL－6大量表達(dá)，而對照組小鼠未出現(xiàn)上述變化，Western blotting檢測結(jié)果也顯示了同樣趨勢。免疫熒光雙標(biāo)記檢測結(jié)果顯示：iNOS、IL－6和TH神經(jīng)元存在共定位。上述現(xiàn)象表明：多巴胺能神經(jīng)元丟失可能與炎癥反應(yīng)存在密切聯(lián)系。

目前，PD的治療仍然是控制癥狀為主。左旋多巴是治療PD的首選藥物，但其并不能阻止PD的病程進(jìn)展，而且長期服用會產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。越來越多的研究［10］顯示：炎癥反應(yīng)可能在PD發(fā)病中起了重要作用，因此抗炎治療有望成為治療PD的重要手段之一。米諾霉素能有效地降低炎癥反應(yīng)，在PD治療中已取得了較好療效。國外學(xué)者研究［11］發(fā)現(xiàn)：羅格列酮可減少神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病中神經(jīng)元的丟失，對神經(jīng)元起到保護(hù)作用。最近文獻(xiàn)［12］報(bào)道：在 MPTP所致PD慢性動物模型中，羅格列酮可以減少小膠質(zhì)細(xì)胞PPAR－γ表達(dá)，減輕多巴胺能神經(jīng)元變性丟失。本研究結(jié)果顯示：與模型組小鼠比較，羅格列酮處理組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)iNOS和IL－6陽性細(xì)胞大幅減少，蛋白水平亦下降，同時(shí)TH陽性神經(jīng)元丟失程度得到明顯減輕。由于MPTP選擇性破壞黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元，導(dǎo)致黑質(zhì)細(xì)胞體、紋狀體神經(jīng)末梢DA遞質(zhì)大量減少，從而出現(xiàn)PD樣癥狀。本實(shí)驗(yàn)采用爬桿試驗(yàn)對小鼠運(yùn)動功能進(jìn)行動態(tài)評估［13］結(jié)果顯示：模型組小鼠產(chǎn)生類似PD樣癥狀體征，肢體協(xié)調(diào)能力差，表現(xiàn)為爬桿所需時(shí)間延長，經(jīng)羅格列酮處理后運(yùn)動功能增強(qiáng)，爬桿時(shí)間明顯縮短。

綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)條件下，MPTP可誘導(dǎo)模型小鼠中腦黑質(zhì)炎癥介質(zhì)iNOS和IL－6的高表達(dá)，多巴胺能神經(jīng)元顯著丟失；羅格列酮可抑制iNOS和IL－6表達(dá)，使多巴胺能神經(jīng)元變性丟失現(xiàn)象有所減輕，從而發(fā)揮一定的神經(jīng)保護(hù)作用。

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Inhibitory effects of rosiglitazone on expressions of iNOS and IL－6 in substantia nigra of mice with Parkinson’s disease and their significances

ZHANG Tian1，WEI Zi－feng2，QIN Li－juan1，ZHOU Hong－xia2，ZHANG Yu－xin2
（1.Department of Physiology，School of Basic Medical Sciences，Hebei United University，Tangshan 063000，China；2.Department of Anatomy，School of Basic Medical Science，Hebei United University，Tangshan 063000，China）

Objective To investigate the regulation of rosiglitazone on iNOS and IL－6 in substantia nigra of the mice with Parkinson’s disease（PD），and to clarify the mechanism.Methods 45 male mice were randomly divided into control group（n＝15），model group（n＝15）and rosiglitazone group（n＝15）.The behavioral changes of the mice in various groups were observed by pole climbing experiment；immunohistochemistry and Western blotting methods were used to observe the expressions of iNOS，IL－6 and TH in substantia nigra of the mice.Results The model mice exhibited typical PD－like behaviors，such as tremor，gait retardation；compared with control group，the time of T－turn and T－LA in model group was prolonged，the differences between two groups were significant（P＜0.05）；Compared with control group，TH－positive neurons lost obviously，the numbers of iNOS，IL－6 and TH immunoreactive cells and the expression levels in substantia nigra of the midbrain were increased markedly，and the differences were statistically significant（P＜0.05）.After treated with rosiglitazone，the changes mentioned above were reduced significantly；there were significant differences of the numbers of iNOS，IL－6 and TH positive cells and their protein expression levels compared with model group（P＜0.05）.Conclusion Rosiglitazone may protect the dopaminergic neurons by inhibiting the expressions of iNOS and IL－6.

Parkinson’s disease；tyrosine hydroxylase；inducible nitric oxide synthase；interleukin－6；rosiglitazone

R745

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1124－05

2012－05－20

河北省科技廳自然科學(xué)基金資助課題（C2004000689）；河北省博士基金資助課題（05547008D－4）；河北省科學(xué)技術(shù)與社會發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目資助課題（04276135）；河北省唐山市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目資助課題（10140201A－15）

張 田（1979－），女，河北省唐山市人，講師，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事帕金森病病因與發(fā)病機(jī)制的研究。

張宇新（Tel：0315－3726421，E－mail：jpzyx＠163.com）