于春艷，韓命龍，鐘加滕，孫連坤，劉玉和

（1.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，吉林 吉林132013；2.吉林市公安局昌邑分局法醫(yī)室，吉林 吉林132001；3.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春130021）

抑制ClC－3表達(dá)對(duì)順鉑誘導(dǎo)人卵巢癌SKOV3／DDP細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用

于春艷1，韓命龍2，鐘加滕3，孫連坤3，劉玉和1

（1.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，吉林 吉林132013；2.吉林市公安局昌邑分局法醫(yī)室，吉林 吉林132001；3.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春130021）

目的：探討抑制氯離子通道－3（ClC－3）基因表達(dá)對(duì)順鉑（DDP）誘導(dǎo)的人卵巢癌SKOV3／DDP細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，為卵巢癌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：轉(zhuǎn)染pSH1－siRNA－ClC－3重組質(zhì)粒至人卵巢癌SKOV3／DDP細(xì)胞，Western blotting方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒對(duì)ClC－3蛋白表達(dá)的影響；MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率；Western blotting方法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白細(xì)胞色素C（Cyt－c）及Caspase－3活化片段蛋白表達(dá)。結(jié)果：與SKOV3細(xì)胞比較，SKOV3／DDP細(xì)胞中ClC－3蛋白表達(dá)水平增加（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染pSH1－siRNA－ClC－3重組質(zhì)粒后，SKOV3／DDP細(xì)胞ClC蛋白表達(dá)水平明顯降低；ClC－3－siRNA聯(lián)合DDP作用后，SKOV3／DDP細(xì)胞增殖率下降（P＜0.05），Cyt－c和Caspase－3活化片段蛋白表達(dá)水平增加（P＜0.05）。結(jié)論：pSH1－siRNA－ClC－3可有效抑制SKOV3／DDP細(xì)胞ClC－3蛋白的表達(dá)，并促進(jìn)DDP誘導(dǎo)SKOV3／DDP細(xì)胞凋亡。

卵巢腫瘤；氯通道－3；順鉑；細(xì)胞凋亡

順鉑（cisplatin，DDP）是臨床上常用的抗腫瘤藥物，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡［1］。然而，采用DDP治療時(shí)常常發(fā)生腫瘤細(xì)胞獲得耐藥性［2－3］而使腫瘤治療無效。目前，腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物發(fā)生藥物耐藥的機(jī)制仍是研究的熱點(diǎn)，有幾種機(jī)制被認(rèn)為與腫瘤細(xì)胞發(fā)生耐藥有關(guān)，例如藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)聚集減少、DNA修復(fù)損傷能力增強(qiáng)和腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡能力降低等，但腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的具體機(jī)制還尚不明確。研究［4］發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞凋亡常常伴隨發(fā)生凋亡細(xì)胞容積減少；而凋亡細(xì)胞容積減少常被某些離子通道例如鉀離子和氯離子通道（chloride channel，ClC）傳導(dǎo)增強(qiáng)、導(dǎo)致離子外流所誘導(dǎo)。當(dāng)?shù)蛲稣T導(dǎo)因子刺激后，ClC的正?；钚酝ㄟ^引起凋亡細(xì)胞容積減少而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生了凋亡［5］。本實(shí)驗(yàn)以人卵巢癌SKOV3、SKOV3／DDP細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察DDP對(duì)SKOV3／DDP細(xì)胞存活率、凋亡蛋白表達(dá)水平的影響，探討ClC－3在卵巢癌細(xì)胞發(fā)生耐藥中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑 人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和SKOV3／DDP購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院和北京協(xié)和醫(yī)院。新生小牛血清 購(gòu)自Gibco公司，Iscove’s Modified Dulbecco’s Media（IMDM）培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；siRNA表達(dá)載體（pSilencer TMneo3.1－H1） 購(gòu) 自 美 國(guó) Ambion 公 司； 脂 質(zhì) 體（lipofectamine2000）試劑購(gòu)自Invitrogen公司；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒提取試劑盒和寡核苷酸合成均購(gòu)自Takara公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）粉末購(gòu)自Sigma公司；細(xì)胞裂解液RIPA購(gòu) 自 碧 云 天 公 司；ClC－3、Cyt－c、Caspase－3、Cleaved Caspase－3 和 β－actin 抗 體 均 購(gòu) 自 Santa Cruz公司；注射用DDP（凍干型）購(gòu)自齊魯制藥有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SKOV3和SKOV3／DDP細(xì)胞均采用含10% 胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液養(yǎng)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2種細(xì)胞均采用0.4%胰酶消化傳代培養(yǎng)。DDP耐受型細(xì)胞株SKOV3／DDP在培養(yǎng)過程中需要加入1 mg·L－1DDP，以維持SKOV3／DDP細(xì)胞表型及耐藥性。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入SKOV3／DDP細(xì)胞內(nèi)，實(shí)驗(yàn)共分4組：轉(zhuǎn)染pSilencer 3.1－H1質(zhì)粒（scramble） 組； 轉(zhuǎn) 染 pSilencer 3.1－H1 質(zhì) 粒 ＋DDP（scramble＋cisplatin）組，DDP終含量為6 mg·L－1，給藥 24 h；轉(zhuǎn)染 pSilencer 3.1－H1－siRNA－ClC－3重組質(zhì)粒（ClC－3－siRNA）組；轉(zhuǎn)染pSilencer 3.1－H1－siRNA－ClC－3 ＋ DDP（ClC－3－siRNA＋ cisplatin）組，DDP終含量為6 mg·L－1，給藥24 h。

1.4 重組質(zhì)粒pSilencerTMneo3.1－H1構(gòu)建 根據(jù)GenBank中人ClC－3基因 mRNA的已知序列（AF191729） 和 本 實(shí) 驗(yàn) 室 前 期 工 作［6］， 在www.amhion.com在線設(shè)計(jì)siRNA模板序列如下：Sense，3′－AGCTACACAAACTGCTTGACCTATGATTAACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG－5′；Aniisense，3′－CGGCGAAGCTTTTTCCAAAAAATTAATCATAGGTCAAGCAGCTACACAAACTGC－5′。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行序列測(cè)定。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞以104／孔接種至96孔板中，每孔接種量為100μL，每組5復(fù)孔，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h，加入5 g·L－1MTT 20μL。培養(yǎng)結(jié)束后，傾去培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞楓（DMSO）150μL，振蕩混勻，使結(jié)晶完全溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度（A）值。設(shè)對(duì)照組細(xì)胞增殖率為100%，其余各組增殖率＝（各組A值／對(duì)照組A值）×100%。

1.6 Western blotting法檢測(cè)蛋白表達(dá)量 待細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為4組，離心收集細(xì)胞，每瓶加入120μL RIPA，混勻，取50μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS－PAGE電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上；5%奶粉室溫封閉2 h后，用含0.01%Tween 20的TBS緩沖液（TBST）漂洗3次，每次10 min；加入相應(yīng)的抗體（1∶200），4℃孵育過夜，TBST漂洗3次后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶1000），37℃搖床溫育2 h；TBST漂洗3次，每次10 min；DAB顯色，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析拍照，并以β－actin作為內(nèi)參照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。細(xì)胞生存率和蛋白表達(dá)水平以±s表示，組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 SKOV3和SKOV3／DDP細(xì)胞中ClC－3蛋白的表達(dá)水平 收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，Western blotting法 分析2種細(xì)胞中的ClC－3蛋白的表達(dá)，與SKOV3 細(xì)胞（0.33±0.03）比較，SKOV3／DDP 細(xì) 胞 中 的 ClC－3蛋 白 表 達(dá) 水 平（1.23±0.06）增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 SKOV3和SKOV3／DDP細(xì)胞中ClC－3蛋白的表達(dá)Fig.1 The expressions of ClC－3 proteins in SKOV3 and SKOV3／DDP cells

2.2 各組SKOV3／DDP細(xì)胞中ClC－3蛋白表達(dá)水平 與scramble組［（98.0±5.7）%］比較，ClC－3－SiRNA 組SKOV3／DDP細(xì)胞內(nèi)ClC－3蛋白表達(dá)水平［（53.7±5.6）%］降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 ClC－3－siRNA 重組質(zhì)粒作用后SKOV3／DDP細(xì)胞中ClC－3蛋白的表達(dá)Fig.2 The expressions of ClC－3 proteins in SKOV3／DDP cells after treated with ClC－3－siRNA plasmid

2.3 抑制ClC－3表達(dá)后SKOV3／DDP細(xì)胞增殖率

對(duì)照組細(xì)胞增殖率設(shè)為100%，scramble＋cisplatin組細(xì)胞增殖率為（95.4±5.2）%；ClC－3－siRNA＋DDP組細(xì)胞增殖率為（63.5±6.5）%，明顯低于scramble＋cisplatin組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 ClC－3－siRNA作用后SKOV3／DDP細(xì)胞凋亡蛋白Cyt－c和Caspase－3活化片段的蛋白表達(dá)水平

Western blotting檢測(cè)，與scramble＋cisplatin組（0.03±0.02）比較，ClC－3－siRNA＋cisplatin組胞漿Cyt－c（0.53±0.16）和 Cleaved Caspase－3（0.36±0.11）蛋白表達(dá)水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 DDP作用下 SKOV3／DDP細(xì)胞 Cyt－c和 Cleaved Caspase－3蛋白的表達(dá)Fig.3 The expressions of Cyt－c and Cleaved Caspase－3 proteins in SKOV3／DDP cells after treated with DDP

3 討 論

DDP是目前臨床上術(shù)后常規(guī)治療方案中聯(lián)合應(yīng)用較廣泛的一線化療藥物，已在卵巢癌、頭頸部腫瘤和肺癌中卓見成效。與其他抗腫瘤藥物一樣，DDP的抗腫瘤活性以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡為主［1，7］。Cyt－c及 Caspase－3蛋白被認(rèn)為是線粒體凋亡誘導(dǎo)因子，上述蛋白激活可以啟動(dòng)細(xì)胞凋亡過程［8］。本文作者的前期研究［9］發(fā)現(xiàn)：DDP作用的SKOV3細(xì)胞中的上述蛋白表達(dá)增加，而SKOV3／DDP細(xì)胞中上述蛋白沒有表達(dá)，提示SKOV3／DDP細(xì)胞可能對(duì)DDP產(chǎn)生耐藥。細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞容積減少，常常發(fā)生在Caspase激活之前［4］。ClC阻斷劑NPPB上調(diào)K562及RK562細(xì)胞的ClC－3表達(dá)，使2種細(xì)胞對(duì)DDP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡不敏感［7］。前期研究［9］結(jié)果顯示：與SKOV3細(xì)胞比較，DDP對(duì)SKOV3／DDP細(xì)胞存活率的抑制作用減弱。本研究結(jié)果顯示：抑制ClC－3表達(dá)增加了DDP對(duì)SKOV3／DDP細(xì)胞存活率的抑制作用，增加了凋亡相關(guān)蛋白Cyt－c和Cleaved Caspase－3表達(dá)，提示ClC－3可能參與了腫瘤細(xì)胞對(duì)DDP產(chǎn)生耐藥性過程。研究［10］發(fā)現(xiàn)：氯離子（Cl－）是體內(nèi)最多的陰離子，其通過跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和陰離子通道發(fā)揮各種生物功能，已經(jīng)證明ClC在細(xì)胞的生理和病理情況下發(fā)揮重要作用，如滲透壓調(diào)節(jié)、離子分泌、細(xì)胞容積調(diào)節(jié)和細(xì)胞遷移及增殖等。抑制氯離子通道ClC－2基因表達(dá)，能抑制DDP作用下神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的侵襲力［11］。ClC－3通過增加細(xì)胞內(nèi)晚期內(nèi)吞體的酸性，增加了DDP的耐藥性［7］。DDP作用下，SKOV3細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白表達(dá)明顯增加，而SKOV3／DDP細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白沒有受影響，推測(cè)SKOV3／DDP細(xì)胞對(duì)DDP耐藥與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子表達(dá)差異有關(guān)［9］。抑制ClC－3表達(dá)通過抑制自噬而增加了DDP對(duì)U251細(xì)胞的敏感并增加了 U251細(xì)胞凋亡［6］。因此，ClC－3引起SKOV3／DDP細(xì)胞對(duì)DDP產(chǎn)生耐藥的機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

［1］Xu Y，Yu HM，Qin HJ，et al.Inhibition of autophagy enhances cisplatin cytotoxicity through endoplasmic reticulum stress in human cervical cancer cells［J］.Cancer Lett，2012，314（2）：232－243.

［2］Chang XB.Molecular mechanism of ATP－dependent solute transport by multidrug resistance－associated protein 1［J］.Methods Mol Biol，2010，596：223－249.

［3］Yu H，Su J，Xu Y，et al.p62／SQSTM1 involved in cisplatin resistance in human ovarian cancer cells by clearing ubiquitinated proteins［J］.Eur J Cancer，2011，47（10）：1585－1594.

［4］Shimizu T，Numata T，Okada Y.A role of reactive oxygen species in apoptotic activation of volume－sensitive Cl－channel［J］.Proc Natl Acad Sc USA，2004，101（7）：6770－6773.

［5］Okada Y，Maeno E，Shimizu T，et al.Dual roles of plamalemmal chloride channels in induction of cell death［J］.Eur J Physio，2004，448（3）：287－295.

［6］蘇 靜.抑制細(xì)胞內(nèi)氯通道對(duì)膠質(zhì)瘤腫瘤生物學(xué)特性影響的研究［D］.長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2010.

［7］Xu Y，Zheng H， Kang JS， et al. 5－Nitro－2－（3－Phenylpropylamino）benzoic acid induced drug resistance to cisplatin in human erythroleukemia cell lines［J］.Anat Rec，2011，294（6）：945－952.

［8］Zhong JT，Xu Y，Yi HW，et al.The BH3 mimetic S1 induces autophagy through ER stress and disruption of Bcl－2／Beclin 1 interaction in human glioma U251 cells［J］.Cancer Lett，2012，323（2）：180－187.

［9］周 彤，于慧美，蘇 靜，等.順鉑誘導(dǎo)人卵巢癌SKOV3和SKOV3／DDP細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激差異的研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011，15（5）：809－811.

［10］Jentsch TJ，F(xiàn)riedrich T，Schriever A，et al.The ClC chloride channel family［J］.Pflugers Arch，1999，437（6）：783－795.

［11］蘇 靜，周 磊，張宏宇，等.氯通道ClC－2反義寡核苷酸對(duì)順鉑作用下神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞侵襲力的影響［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2009，35（1）：43－46.

Promoting effect of inhibiting ClC－3 expression on apoptosis induced by cisplatin in human ovarian cancer SKOV3／DDP cells

YU Chun－yan1，HAN Ming－long2，ZHONG Jia－teng3，SUN Lian－kun3，LIU Yu－h(huán)e1
（1.Department of Pathology，College of Basic Medicine，Beihua University，Jinlin 132013，China；2.Department of Firensic Medicine，Jilin Public Security Bureau Changyi Branch，Jinlin 132001，China；3.Department of Pathophysiology，Norman Bethune College of Medicine，Jilin University，Changchun 130021，China）

Objective To observe the promoting effect of inhibiting chloride channel－3（ClC－3）gene expression on the apoptosis of human ovarian cancer SKOV3／DDP cells induced by cisplatin（DDP），and to provide the experimental basis for treatment of ovarian cancer.Methods The recombinant plamid pSH1－siRNA－ClC－3 was transfected into SKOV3／DDP cells.The ClC－3 expression changes in SKOV3／DDP cells transfected with pSH1－SiRNA－ClC－3 was detected by Western blotting.The vitality of SKOV3／DDP cells was measured by MTT assay.The expression levels of apoptosis－related proteins cytochrome C（Cyt－C）and Cleaved Caspase－3 were determined by Western blotting.Results Compared with SKOV3 cells，the ClC－3 expression levels in SKOV3／DDP cells was increased（P ＜0.05）.Transfection of pSH1－SiRNA－ClC－3 suppressed the expression of ClC－3 efficiently in SKOV3／DDP cells（P＜0.05）.The proliferation rate of SKOV3／DDP cells was decreased（P＜0.05），and the cyt－C and Cleaved Caspase－3 expression were increased after treated with ClC－3－siRNA combined with DDP（P＜0.05）.Conclusion pSH1－SiRNA－ClC－3 could suppress the expression of ClC－3 efficiently and enhance the apoptosis induced by DDP in SKOV3／DDP cells.

ovarian tumor；chloride channel－3；cisplatin；apoptosis

R737.31

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1106－04

2012－06－19

吉林省教育廳資助課題（吉教科合字2009第156號(hào)，吉教科合字2011第117號(hào)，吉教科合字2012第394號(hào)）；吉林省科技廳自然科學(xué)基金資助課題（201215103）

于春艷（1975－），女，吉林省吉林市人，副教授，醫(yī)學(xué)博士，主要從事腫瘤病理學(xué)方面的研究。

劉玉和（Tel：0432－64608556，E－mail：bhlyh1959＠163.com）