張小梅，方廖瓊，王智彪

（重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 省部共建超聲醫(yī)學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室超聲醫(yī)學(xué)工程重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016）

小鼠成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備及C57BL／6小鼠胚胎干細(xì)胞系的建立

張小梅，方廖瓊，王智彪

（重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 省部共建超聲醫(yī)學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室超聲醫(yī)學(xué)工程重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016）

目的：制備小鼠成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層并建立C57BL／6小鼠胚胎干細(xì)胞（ESC）系，為進(jìn)一步建立人ESC系提供依據(jù)。方法：取妊娠12.5～14.5 d的胎鼠，組織消化法分離培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）；收集C57BL／6小鼠3.5 d的囊胚培養(yǎng)于小鼠制作的飼養(yǎng)層上；分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM），擴(kuò)增傳代40代以上。觀察ESC集落的生長(zhǎng)情況。采用堿性磷酸酶（AKP）染色、免疫組織化學(xué)早期胚胎特異性表面抗原（SSEA－1）、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（OCT－4）染色和體內(nèi)分化實(shí)驗(yàn)對(duì)ESC集落進(jìn)行鑒定。結(jié)果：分離培養(yǎng)后得到的ESC可穩(wěn)定傳代至40代以上，且均呈集落樣生長(zhǎng)。經(jīng)AKP、SSEA－1和OCT－4染色后ESC均呈紅褐色陽性表達(dá)，接種于裸鼠均可形成畸胎瘤；HE染色，有3個(gè)胚層組織成分。結(jié)論：成功建立了C57BL／6小鼠ESC系。

胚胎成纖維細(xì)胞；C57BL／6小鼠；胚胎干細(xì)胞；堿性磷酸酶

胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和原始生殖細(xì)胞中分離出來的全能干細(xì)胞，具有無限增殖和全能分化的潛力。由于小鼠ESC具有胚胎嵌合和生殖系嵌合能力［1］以及在特定條件下可定向分化［2－3］等的特性，因此近年來ESC在早期胚胎發(fā)育研究［4］、基因打靶技術(shù)的改進(jìn)［5］和利用細(xì)胞移植進(jìn)行疾病的治療［6］等研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。ESC已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。ESC的建系是一項(xiàng)基礎(chǔ)性的工作，不同品系小鼠ESC的建系效率有很大的差異，建系途徑和方法各有特點(diǎn)，一個(gè)品系ESC的建系方法不一定都適合于其他品系，而ESC研究的基礎(chǔ)與核心是有效地分離并建立穩(wěn)定的ESC系。本研究嘗試用自制的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，分離培養(yǎng)C57BL／6小鼠ESC，最終建立穩(wěn)定C57BL／6小鼠ESC系，為進(jìn)一步的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為建立人ESC系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、主要試劑及儀器 健康、成年C57BL／6小鼠，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，8～10周齡，體質(zhì)量20～25 g，25℃環(huán)境下飼養(yǎng)，光照周期12 h，自由攝水、飲食，挑選發(fā)情期雌性小鼠按1∶1比例進(jìn)行雌、雄鼠合籠過夜，次晨發(fā)現(xiàn)陰栓者為孕第l天。H－DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶（Hyclone公司）；胎 牛 血 清（FBS）（Gibco公司）；絲裂霉素C（mitomycin C，MMC）（Roche公司）；C57BL／6小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)基（廣州賽業(yè)生物科技有限公司）；BCIP／NBT堿性磷酸酯酶（alkaline phosphatase，AKP）顯色試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；Anti－SSEA－1、Anti－OCT－4抗體（Millopre公司）；兔SPKit一抗為兔來源的免疫組化試劑盒（sp－0023）、鼠SPKit一抗為鼠來源的免疫組化試劑盒（sp－0024）（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。TC 2323 型 二 氧 化 碳 孵 箱（Shel－Lab）；LX70型倒置顯微鏡（Olympus公司）。

1.2 小鼠MEF的分離培養(yǎng) 取12.5～14.5 d的妊娠小鼠，斷頸處死。無菌條件下取出小鼠子宮，分離胎鼠，PBS充分洗滌；去除胎鼠的頭、尾、四肢和內(nèi)臟，PBS液洗凈，用滅菌的眼科剪將剩余組織剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，向組織塊加入適量0.25%胰蛋白酶＋0.04%EDTA消化液，輕輕吹打數(shù)次，室溫或37℃消化3～5 min，加等體積含血清培養(yǎng)基終止消化，靜置3～5 min后收集上層懸液；重復(fù)上步操作2～5遍，組織基本可以消化完全；收集的細(xì)胞懸液800～1000 r·min－1離 心 5 min，培 養(yǎng) 液（HDMEM＋10%FBS）重懸細(xì)胞至培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)第2天初次換液，以后視細(xì)胞情況隔天換液，細(xì)胞匯合度達(dá)80%以上后，按1∶3～1∶5傳代。

1.3 MEF飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備 采用純化的P2～4代MEF細(xì)胞制備飼養(yǎng)層，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)融合80%時(shí)，用10 g·L－1的 MMC處理3 h，以每孔2×105的密度接種到0.1%明膠包被過的六孔板中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后可作飼養(yǎng)層細(xì)胞使用，用前去除原培養(yǎng)基，PBS洗1～2次后更換成小鼠ESC完全培養(yǎng)基即可供ESC培養(yǎng)。

1.4 ESC的分離培養(yǎng)與傳代 無菌取出妊娠3.5 d小鼠子宮，4號(hào)針頭沖胚，解剖顯微鏡下收集發(fā)育良好的囊胚，置于飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，48～72 h后透明帶自行脫落，內(nèi)細(xì)胞群（inner cell mass，ICM）孵出并長(zhǎng)大。4～5 d后用自制的毛細(xì)針挑取ICM，使之與飼養(yǎng)層和滋養(yǎng)層細(xì)胞分離，并吸至消化液小滴內(nèi)（0.25%胰蛋白酶＋0.04%EDTA混合消化液），使ICM在消化液小滴內(nèi)作用3～5 min，并用自制的玻璃微針輕輕吹吸ICM數(shù)次，使之分散成若干個(gè)由細(xì)胞組成的小團(tuán)塊，這時(shí)可繼續(xù)將ICM消化成單細(xì)胞，再接種于新的飼養(yǎng)層鋪板的6孔板中。3～5 d后挑取單個(gè)干細(xì)胞集落微滴消化離散，接種于新的飼養(yǎng)層上，傳代至3代左右，一般3～5 d即可傳代，直接加入適量0.25%胰蛋白酶＋0.04%EDTA混合消化液消化ESC，37℃或者室溫作用2～4 min，收集細(xì)胞后接種于新的飼養(yǎng)層上。

1.5 ESC細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定 在倒置顯微鏡下觀察囊胚、ICM和ES集落的形態(tài)，觀察其生長(zhǎng)特征。

1.6 AKP染色觀察ESC ESC傳代培養(yǎng)后48～72 h，棄去原培養(yǎng)液，用PBS洗凈，加入適量4%多聚甲醛溶液固定2～5 min，染色過程按照BCIP／NBT AKP顯色試劑盒的說明操作，普通光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞被染成深藍(lán)色至藍(lán)紫色為陽性細(xì)胞，蘇木精復(fù)染10 min后，水洗，涼干，光鏡下觀察、拍照，細(xì)胞被染成紅褐色為AKP表達(dá)陽性細(xì)胞。

1.7 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)ESC中階段特異性胚胎 抗 原 1（stage specific embrynic antigen 1，SSEA－1）和 八聚 體 結(jié) 合 轉(zhuǎn) 錄 因 子4（octamerbinding transcription factor－4，OCT－4）表達(dá) 將飼養(yǎng)層細(xì)胞制備于10 mm×10 mm載玻片上，24 h后換ESC完全培養(yǎng)基，并將ESC按照1∶5傳代培養(yǎng)于該飼養(yǎng)層上，培養(yǎng)48～72 h后，棄去原培養(yǎng)液，用PBS洗凈，加入適量4%多聚甲醛溶液固定30 min；PBS清洗標(biāo)本3次，每次2 min；0.5%Triton X－100 孵 育 20 min；PBS 清 洗 標(biāo) 本3次，每次2 min；3%H2O2去離子水孵育10～15 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；分別滴加SP－0023、SP－0024試劑盒中試劑A室溫孵育10～15 min，傾去，勿洗；分別加入1∶100稀釋后的一抗SSEA－1 Moues Ig M和1∶1000稀釋后的一抗OCT－4 Rabbit IgG，4℃過夜；后續(xù)步驟分別按照SP－0023、SP－0024試劑盒和DAB顯色試劑盒說明書進(jìn)行操作，染色后普通光學(xué)顯微鏡觀察、拍照，細(xì)胞被染成紅褐色為SSEA－1和OCT－4表達(dá)陽性細(xì)胞。1.8 ESC在小鼠體內(nèi)分化能力的鑒定 ESC傳代后48～72 h，消化離心收集細(xì)胞后，用少量PBS重懸計(jì)數(shù)，在裸鼠左下肢腹股溝處皮下注射點(diǎn)接種約5×105個(gè)ESC，飼養(yǎng)6～8周，取生成的腫塊切片，常規(guī)HE染色，觀察ESC在體內(nèi)的生長(zhǎng)、分化情況。

2 結(jié) 果

2.1 MEF形態(tài)學(xué)變化 MEF細(xì)胞為貼壁型生長(zhǎng)細(xì)胞，大小不均。顯微鏡下觀察，細(xì)胞成梭形、多邊形或條帶狀，胞質(zhì)透明，細(xì)胞質(zhì)中央為卵圓形核，周邊向外伸出纖維狀偽足，細(xì)胞生長(zhǎng)較快，隨著細(xì)胞的增殖逐漸連接成片。原代MEF細(xì)胞形態(tài)多樣（圖1A），有其他細(xì)胞混雜，傳代過程中雜細(xì)胞逐漸被去除。2～5代的細(xì)胞純度狀態(tài)均較好（圖1B、C），分裂增殖較快，生長(zhǎng)旺盛。第6代以后細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形態(tài)變異，體積增大，立體感明顯變差，且細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯粗顆粒區(qū)，細(xì)胞之間空隙較大，呈衰老征象（圖1D）。因此選擇第2～5代MEF作為飼養(yǎng)層細(xì)胞較好。

圖1 光鏡下不同代數(shù)MEF細(xì)胞形態(tài)學(xué)（×100）Fig.1 The morphology of MEF cells at different generations under light microscope（×100）

2.2 飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備情況 光學(xué)顯微鏡下觀察，經(jīng)MMC處理后，MEF細(xì)胞貼壁較慢，失去分裂增殖能力，制備的MEF飼養(yǎng)層生長(zhǎng)狀態(tài)良好，處理前后細(xì)胞形態(tài)基本無異。見圖2。

2.3 囊胚、ICM及ESC的生長(zhǎng)狀態(tài) 囊胚培養(yǎng)24～48 h開始脫帶貼壁，培養(yǎng)3～5 d，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)迅速增殖凸起，呈現(xiàn)卵圓柱狀或鳥巢狀，此時(shí)可以分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。ESC有其典型的形態(tài)學(xué)特征：ESC增殖旺盛，細(xì)胞間緊密，呈典型的 “鳥巢狀”生長(zhǎng)，邊緣清晰，表面光滑，結(jié)構(gòu)致密，與飼養(yǎng)層細(xì)胞間界限清晰；第1、2代時(shí)細(xì)胞集落形成稍慢，以后一般生長(zhǎng)4 d或5 d即可傳代，傳到第40代內(nèi)細(xì)胞集落形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞間緊密，邊緣分化細(xì)胞極少或未見分化細(xì)胞。見圖3（插頁一）。

圖2 光鏡下MMC處理前后MEF細(xì)胞形態(tài)學(xué)（×100）Fig.2 The morphology of MEF cells before and after treated with MMC under light microscope（×100）

2.4 ESC的AKP染色結(jié)果 AKP染色，未分化的P2～40代ESC經(jīng)染色后成紅褐色，飼養(yǎng)層未著色，ESC邊緣規(guī)則，與飼養(yǎng)層界限清楚。見圖4（插頁一）。

2.5 ESC的SSEA－1和OCT－4免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 免疫組織化學(xué)染色，未分化的P2～40代ESC的SSEA－1和OCT－4染色后均呈紅褐色，即陽性表達(dá)，而飼養(yǎng)層未著色，ESC邊緣規(guī)則，與飼養(yǎng)層界限清楚。見圖5和6（插頁一）。

2.6 體內(nèi)分化能力鑒定 ESC接種在裸鼠左下肢腹股溝后約2周左右開始出現(xiàn)明顯可見的包塊長(zhǎng)出；培養(yǎng)6～8周后，包塊平均約有2.5 cm×1.5 cm×1.2 cm大小，取生成的腫塊切片，行常規(guī)HE染色，觀其組織成分包含外、中和內(nèi)3個(gè)胚層的多種組織成分。見圖7（插頁二）。

3 討 論

自1981年Evans等［7］首次成功地從著床前小鼠胚胎ICM成功分離并建立小鼠ESC系以來，人們已經(jīng)成功地從ESC誘導(dǎo)出不同胚層的細(xì)胞和器官組織，ESC還可以與受體胚胎嵌合，形成嵌合體，并可在體外進(jìn)行各種基因操作。目前，ESC已經(jīng)成為研究哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)生、細(xì)胞組織分化和基因表達(dá)調(diào)控等的理想模型，并可為未來臨床細(xì)胞替代療法和組織器官移植等提供無盡的供體來源。

體外維持ESC未分化狀態(tài)的增殖培養(yǎng)是研究ESC生物學(xué)特點(diǎn)和應(yīng)用ESC的前提基礎(chǔ)。ESC培養(yǎng)主要采用飼養(yǎng)層細(xì)胞，已形成一種常規(guī)且穩(wěn)定的ESC培養(yǎng)方式。目前，用于制備飼養(yǎng)層的細(xì)胞有原代MEF及已成系的MEF系STO細(xì)胞。其中原代MEF取材容易，價(jià)格低廉，在ESC建系、擴(kuò)增培養(yǎng)中最為常用。本研究參照目前較規(guī)范的原代MEF分離培養(yǎng)方法，在實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)獲得原代MEF，并制備了飼養(yǎng)層細(xì)胞，能夠很好地支持ESC生長(zhǎng)，分離的小鼠ESC集落增殖呈典型的鳥巢狀，其細(xì)胞圓小，細(xì)胞核大，排列緊密，邊緣清晰，細(xì)胞之間界限不清楚，符合小鼠ESC的一般特性。

AKP相對(duì)分子質(zhì)量為56000，屬于同源二聚體蛋白。每個(gè)單體由449個(gè)氨基酸組成，完整的AKP分子呈現(xiàn)典型的α／β的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，同時(shí)每個(gè)單體均具有1個(gè)活性中心。AKP的高表達(dá)，與未分化的多能干細(xì)胞相關(guān)，因此AKP染色可作為檢測(cè)未分化狀態(tài)ESC的一個(gè)重要的標(biāo)志［8－9］。未分化ESC中會(huì)表達(dá)豐富的AKP，己分化的干細(xì)胞中表達(dá)減少或消失，而且往往該酶活性越高的ESC才具有更廣泛的分化能力［10］。ESC具有表達(dá)早期胚胎細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞（embryonic germ cell，EGC）表面抗原的特性。早期胚胎階段特異性抗原SSEA－1、3、4是球形的糖脂，能被單克隆抗體所識(shí)別檢測(cè)到。因?yàn)榇嬖诜N屬差異，小鼠ESC只表達(dá)早期胚胎細(xì)胞的特異性表面抗原SSEA－1，而不表達(dá) SSEA－3和 SSEA－4［11］，表現(xiàn)出 SSEA－1陽性。常用單克隆抗體SSEA－1檢測(cè)ES細(xì)胞表面抗原作為發(fā)育全能性的一種標(biāo)志。本研究中對(duì)傳至第P2～40代的細(xì)胞集落進(jìn)行AKP染色及SSEA－1免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果均呈強(qiáng)陽性，這說明分離培養(yǎng)出的ESC集落保持著未分化狀態(tài)及發(fā)育全能性，持續(xù)傳代培養(yǎng)后其ESC特性仍保存，說明培養(yǎng)的ESC較穩(wěn)定。

OCT－4是POU轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，是由POU5F1基因編碼。高水平的OCT－4的表達(dá)被認(rèn)為與 ESC全能性有關(guān)［12－13］。小鼠的 OCT－4是一種有352個(gè)氨基酸序列的蛋白質(zhì)，且在小鼠中OCT－4只限定在多潛能細(xì)胞中表達(dá)［14］。Guo等［15］的研究結(jié)果表明：受精卵所表達(dá)的OCT－4對(duì)建立ESC系是必需的，目前OCT－4也同樣廣泛地用于鑒定ESC是否處于未分化狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)傳至第P0～35代的細(xì)胞集落OCT－4表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果表明：培養(yǎng)的ESC的OCT－4產(chǎn)物陽性，進(jìn)一步證明分離培養(yǎng)的ESC處于未分化的多潛能狀態(tài)。

ESC發(fā)育多能性是指ESC可以分化成各種體細(xì)胞，包括生殖細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)體內(nèi)分化研究過程中所獲得的畸胎瘤中存在多種組織細(xì)胞，如一些管狀結(jié)構(gòu)、神經(jīng)樣組織和肌肉組織，進(jìn)一步證明所分離獲得的小鼠ESC具有分化發(fā)育成源于3個(gè)胚層的組織細(xì)胞類型的能力。

本研究通過提取原代MEF制備飼養(yǎng)層，利用體內(nèi)發(fā)育的早期胚胎分離獲得的ESC體內(nèi)外均具有分化的多能性且具備小鼠ESC典型特征，因此建立了穩(wěn)定的小鼠ESC系，可為進(jìn)一步建立人ESC系提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。小鼠ESC的成功分離培養(yǎng)為本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步進(jìn)行ES組織工程研究和人ESC系的建立等工作奠定基礎(chǔ)。

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Preparation of mouse fibroblast feeder layers and establishment of embryonic stem cell lines of C57BL／6 mice

ZHANG Xiao－mei，F(xiàn)ANG Liao－qiong，WANG Zhi－biao
（Key Laboratory of Ultrasound Engineering in Medicine Co－founded by Chongqing and Ministry of Science and Technology，Chongqing Key Laboratory of Ultrasound Engineering in Medicine，School of Biomedical Engineering，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

Objective To prepare mouse fibroblast feeder layers and to establish C57BL／6 mouse embryonic stem cell（ESC）lines and to provide basis for the further establishment of human ESC lines.Methods The mouse embryonic fibroblasts（MEF）were isolated from the mouse embryos at 13.5－14.5 d by primary tissue digestion method and the 3.5 d blastulae of C57BL／6 mice were cultured on the mouse fibroblast feeder layer incubation；the inner cell mass（ICM）was separated and amplified and passaged over 40 generations.The growth of the MEF colonies was observed.The ESC colonies were identified by alkaline phosphatase（AKP）staining，early embryospecific surface antigen（SSEA－1） and octamer－blinding transcription factor 4（OCT－4） staining，and differentiation experiments in vivo.Results The ESC after isolation and culture could stably passage to more than 40 generations and showed a colony－like growth.The ESC showed a red－brown positive expression after AKP，SSEA－1 and OCT－4 staining.The teratomas formed after ESC was inoculated in nude mice.HE staining showed that there were three germ layer tissue components in ESC.Conclusion The C57BL／6 mouse ESC lines are successfully established.

embryonic fibroblast；C57BL／6 mouse；embryonic stem cell；alkaline phosphatase

Q132.8

A

2012－04－28

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）項(xiàng)目資助課題（2011CB707902）

張小梅（1986－），女，重慶市人，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事胚胎干細(xì)胞與腫瘤相互作用關(guān)系方面的研究。

王智彪（Tel：023－68485021，E－mail：wangzhibiao＠haifu.com）

1671－587Ⅹ（2012）06－1081－05