黃梁滸 陳津 王慶華 馬予潔 譚建明

前言

根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)療服務(wù)標(biāo)準(zhǔn)專業(yè)委員會制定的基本原則，結(jié)合《人體細(xì)胞治療研究和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》、《藥物臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范》、《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》、《消毒管理辦法》、《臨床實(shí)驗(yàn)室廢物處理原則》等規(guī)范性文件，制定《成人胰島分離、純化、培養(yǎng)、移植前制備技術(shù)規(guī)范》，簡稱臨床成人胰島細(xì)胞制備技術(shù)規(guī)范[1-2]。

一、范圍

本項(xiàng)技術(shù)規(guī)范規(guī)定了成人胰腺器官的接收、胰腺修剪、胰島消化、胰島純化、胰島計(jì)數(shù)、胰島培養(yǎng)、胰島移植前制備以及以上一系列操作過程的質(zhì)量控制等要求。

本項(xiàng)技術(shù)規(guī)范適用于在GMP層流實(shí)驗(yàn)室條件下成人胰島的分離、純化、培養(yǎng)與移植前制備，以及該過程中所涉及的質(zhì)量控制。本項(xiàng)技術(shù)規(guī)范不適用于嬰幼兒、其他物種的胰島分離純化等實(shí)驗(yàn)。

二、規(guī)范性引用文件

下列文件對于本規(guī)范的應(yīng)用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，僅注明日期的版本適用于本文件。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

《人體細(xì)胞治療研究和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》，《藥物臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范》，《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》，《消毒管理辦法》，《臨床實(shí)驗(yàn)室廢物處理原則》。

三、術(shù)語和定義（下列術(shù)語和定義適用于本文件）

1.胰島分離（islet isolation）應(yīng)用膠原酶和機(jī)械作用力，將胰島從胰腺腺泡細(xì)胞包裹狀態(tài)中快速分離出來的過程。

2.胰島純化（islet purification）胰腺經(jīng)膠原酶和機(jī)械作用力作用后，其產(chǎn)物為胰島和腺泡細(xì)胞混合物，無法達(dá)到胰島移植的要求。通過一定大小的離心力作用后，按直徑大小不同，將疊加在淋巴細(xì)胞分離液（ficoll分離液）上方的胰島和腺泡細(xì)胞（連續(xù)或不連續(xù)密度梯度），分布在不同密度的分離液中，分段收集，從而得到純度較高的胰島。

3.胰島計(jì)數(shù)（islet enumberation）在標(biāo)尺顯微鏡下，將經(jīng)雙硫脘染色后的胰島，按直徑（51～100、101～150、151～200、201～250、251～300、301～350、351～400、> 400 μm）大小進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，并將乘以相應(yīng)系數(shù)的各個直徑范圍胰島數(shù)目求和，從而得到該分離胰腺的胰島當(dāng)量。

4.胰島純度（islet purity）胰島計(jì)數(shù)后，根據(jù)胰島直徑大小估算胰島細(xì)胞數(shù)目，并計(jì)數(shù)顯微鏡下胰腺腺泡細(xì)胞的數(shù)目，計(jì)算胰島細(xì)胞在所有細(xì)胞的百分比。

四、縮略語

1.IEQ ：islet equivalent，胰島當(dāng)量。

2.HSA ：human serum albumin，人血清白蛋白。

3.UWS ：university of wisconsin solution，威斯康星大學(xué)溶液。

4.BSC ：bio-safety cabinet，生物安全柜。

5.GMP ：goods manufacturing practice，藥 品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范。

6.CO2：carbon dioxide，二氧化碳。

7.HBV ：hepatitis B virus，乙型肝炎病毒。

8.HCV ：hepatitis C virus，乙型肝炎病毒。

9.HIV ：human immunodeficiency virus，人類免疫缺陷病毒。

10.CMV ：cytomegalo virus，巨細(xì)胞病毒。

技術(shù)規(guī)范

一、胰島細(xì)胞制備的實(shí)驗(yàn)室條件

（一）一般要求

1.所有與胰島分離相關(guān)的儀器設(shè)備應(yīng)做周保養(yǎng)、月保養(yǎng)，并記錄。

2.所有用數(shù)字顯示相關(guān)數(shù)據(jù)的儀器，如冷庫、離心機(jī)、冰箱、天平、移液器、恒溫水育箱、消化罐溫度探針等，首次使用前均需經(jīng)計(jì)量檢測部門檢測合格后方可使用，定期檢測并記錄。

3.所有儀器每次使用后應(yīng)及時(shí)消毒保養(yǎng)處理。

4.所有與胰島分離相關(guān)的儀器設(shè)備應(yīng)有操作使用說明，應(yīng)制定并張貼出儀器運(yùn)行的合理范圍，當(dāng)儀器出現(xiàn)故障、應(yīng)急情況時(shí)應(yīng)有相應(yīng)處理方案。

（二）層流凈化

1.若是新建層流凈化，必須經(jīng)省級以上具有相應(yīng)資質(zhì)的單位檢測合格后，方可正常使用。每兩年應(yīng)進(jìn)行一次凈化功能檢測，由省級以上單位實(shí)施，并出具檢測報(bào)告。

2.層流凈化的設(shè)計(jì)工藝應(yīng)為正壓向下式，其中高效過濾網(wǎng)應(yīng)每兩年更換一次。進(jìn)風(fēng)口應(yīng)位于上風(fēng)口，進(jìn)風(fēng)口的中效過濾網(wǎng)應(yīng)每半年更換一次，初效過濾網(wǎng)視環(huán)境的潔凈程度而定，更換周期不能超過三個月。出風(fēng)口應(yīng)位于進(jìn)風(fēng)口風(fēng)向的下游。

3.層流凈化的等級應(yīng)≤十萬級，其中實(shí)驗(yàn)區(qū)域，包括操作間、細(xì)胞培養(yǎng)間、冷庫（4℃）、離心區(qū)域等應(yīng)在萬級以下。

4.層流凈化的人流、物流通道應(yīng)分離，不得使用同一條通道。所有通道均應(yīng)為單向走向，不得回頭。在不同等級的凈化區(qū)域之間應(yīng)設(shè)立緩沖區(qū)。

5.應(yīng)定期檢查并登記層流凈化的溫濕度。

（三）離心機(jī)

應(yīng)定期清潔，并定期校驗(yàn)離心機(jī)的離心速度。定期檢查和添加離心機(jī)軸的潤滑油。

（四）二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱

1.應(yīng)定期清洗并檢查培養(yǎng)箱，每個工作日檢查指示的培養(yǎng)箱內(nèi)溫度和CO2濃度。應(yīng)注明最高與最低溫度控制，應(yīng)制定并張貼出儀器運(yùn)行的合理范圍，當(dāng)讀數(shù)超過合理范圍時(shí)應(yīng)有相應(yīng)處理方案。每周檢查貯氣瓶氣體至少1次。

2.至少應(yīng)建立兩個獨(dú)立的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中1個溫度為37℃，另一個溫度為22℃。

（五）4℃冷庫

胰島制備實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備1個6 m2左右大小的冷庫，其溫度范圍應(yīng)在2～8℃。若是首次使用，應(yīng)在打開冷庫后，至少平衡24 h方可使用。

（六）細(xì)胞淘洗儀（COBE儀）

一個標(biāo)準(zhǔn)胰島制備實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備2臺或以上的COBE儀。COBE儀應(yīng)擺放于4℃冷庫，保證整個胰島純化過程始終處于低溫狀態(tài)。

（七）生物安全柜（BSC）

應(yīng)定期作日、周、月保養(yǎng)。并定期檢測和更換過濾網(wǎng)的功效。定期更換安全柜內(nèi)的紫外線消毒燈管。

（八）冰箱

1.4℃冰箱 每臺冰箱應(yīng)放置至少1個溫度計(jì)，應(yīng)每日觀察并記錄冰箱溫度。

2.-20℃冰箱 應(yīng)每日觀察并記錄冰箱溫度，并定期檢測。定期或不定期檢查冰箱的結(jié)霜程度，并清除之。

3.超低溫冰箱 應(yīng)每日觀察并記錄冰箱溫度。定期清潔冰箱濾網(wǎng)。

二、臨床用成人胰島細(xì)胞的制備

（一）供體器官的接收登記

收到供體胰腺器官后，應(yīng)立即核對供體姓名、性別、年齡、ABO血型是否與申請單一致，核對供體的病原學(xué)檢查結(jié)果是否全部正常，包括肝功、乙型肝炎病毒（HBV）、乙型肝炎病毒（HCV）、人類免疫缺陷病毒（HIV）、巨細(xì)胞病毒（CMV）抗體、梅毒螺旋體檢測。若信息完全一致，則給予一個胰腺分離的惟一編號（實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的編號系統(tǒng)），并在接收登記本和相關(guān)表格上登記；若發(fā)現(xiàn)有不一致時(shí)，應(yīng)立即與臨床醫(yī)師取得聯(lián)系，再一次核對相關(guān)信息，確認(rèn)完全一致后，進(jìn)行編號、登記，否則應(yīng)作退回處理。

（二）試劑配制

1.所有試劑的配制應(yīng)在BSC內(nèi)完成，同時(shí)應(yīng)注明配制人姓名、配制日期和配制試劑的名稱或縮寫。完成試劑配制后，應(yīng)立即貼上相應(yīng)的標(biāo)簽。

2.所有試劑應(yīng)在胰島分離程序前2～3 h內(nèi)完成，由于整個程序所用到的試劑較多，應(yīng)按照完成一種試劑配制，立即進(jìn)行相關(guān)登記，然后再開始另一種試劑配制的順序進(jìn)行。

3.每次配制完畢，要重新檢查和記錄每種試劑的數(shù)量。應(yīng)在記錄表上注明每種試劑的廠家、批號和有效期，以備查詢。配制后的試劑一旦打開，只能在4℃下保存24 h。

4.所有試劑中，除了雙硫腙染液、移植時(shí)應(yīng)用的CMRL 1066培養(yǎng)液外，其它試劑均應(yīng)存放于4℃環(huán)境。

（三）胰島分離、純化、培養(yǎng)、移植前制備

1.一般要求

從胰腺修剪、清洗、消毒，到最后完成培養(yǎng)、移植前制備，所有操作應(yīng)在層流條件下BSC內(nèi)進(jìn)行，從胰腺保存至胰島培養(yǎng)前，所有操作應(yīng)在冰水浴或4℃下進(jìn)行。

2.胰腺修剪

在開始修剪胰腺前，應(yīng)先完成標(biāo)本取樣，送檢進(jìn)行細(xì)菌革蘭染色鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)、真菌培養(yǎng)、支原體檢測、內(nèi)毒素檢測等。腺體應(yīng)用鈍性器械分離，完全去除脂肪組織、血管、其他結(jié)締組織，但胰腺外膜保持完整。

3.胰腺消毒清洗

應(yīng)嚴(yán)格控制在聚維酮碘液消毒時(shí)間，以免胰腺沾染上較多的碘液。當(dāng)發(fā)現(xiàn)腺體沾染較多碘液時(shí)，應(yīng)增加洗滌次數(shù)。

4.胰腺插管和灌注：（1）插管針應(yīng)選用16G或18G，過小易造成泄漏，過大則造成胰腺機(jī)械性損傷；（2）酶液灌注一定要充分膨脹。若胰腺出現(xiàn)滲漏，用無菌止血鉗止漏。若發(fā)現(xiàn)胰腺的某些部位膨脹不充分，用18G或20G的針頭直接對這些區(qū)域進(jìn)行組織內(nèi)注射。（3）胰腺應(yīng)切成大小均勻一致的7～9塊。

5.胰腺消化：（1）消化終點(diǎn)的判定十分重要，這關(guān)系到胰島分離的成功與否，應(yīng)對消化混合物多加觀察。當(dāng)觀察到消化終點(diǎn)時(shí)，應(yīng)立即中止消化開始稀釋過程；（2）間隔2min應(yīng)取樣一次；（3）振搖消化罐的頻率應(yīng)先慢后快，振搖力度應(yīng)控制在剛好將組織搖起。

6.胰島收集離心：（1）收集過程應(yīng)多人配合，動作快速不混亂；（2）每個離心管的胰島組織應(yīng)至少離心洗滌3次；（3）洗滌完畢，應(yīng)根據(jù)純化方法的不同加入不同的試劑重懸胰島混合物。

7.胰島純化：（1）應(yīng)嚴(yán)格按照操作程序安裝COBE袋，加入150ml Ficoll液后，應(yīng)注意排氣；（2）在疊加Ficoll分離液和組織混合液時(shí)，應(yīng)按順序疊加；（3）離心后，應(yīng)分段收集純化后胰島。

8.胰島計(jì)數(shù)：（1）應(yīng)配備帶標(biāo)尺的顯微鏡，物鏡應(yīng)至少具有4×、10×兩種鏡頭；（2）由于胰島細(xì)胞團(tuán)易發(fā)生沉淀，取樣前必須徹底混懸胰島，使取樣具有代表性；（3）直徑≥50 μm的胰島才列入計(jì)數(shù)范圍，根據(jù)下表進(jìn)行計(jì)數(shù)，并根據(jù)轉(zhuǎn)換系數(shù)和稀釋倍數(shù)計(jì)算胰島當(dāng)量（IEQ）：IEQ=稀釋倍數(shù)×[(直徑50～100 μm的胰島數(shù)平均值÷ 6)+(直徑 101～150 μm 的 胰 島 數(shù) 平 均 值 ÷ 1.5)+(直徑151～200 μm的胰島數(shù)平均值×1.7 )+(直徑201～250 μm的胰島數(shù)平均值×3.5 )+（直徑251～300 μm的胰島數(shù)平均值×6.3 )+(直徑301～350 μm的胰島數(shù)平均值×10.4)+(直徑351～400 μm的胰島數(shù)平均值×15.8)+(直徑為> 400 μm的胰島數(shù)平均值×22.7)]；（4）根據(jù)細(xì)胞顯色不同（胰島細(xì)胞呈鮮紅色、腺泡細(xì)胞為棕色），顯微鏡下估算胰島純度，即胰島細(xì)胞占所有細(xì)胞數(shù)量的百分比。

表1 胰島直徑、平均體積、轉(zhuǎn)換系數(shù)對應(yīng)表

9.胰島培養(yǎng)：（1）在37℃的培養(yǎng)時(shí)間不得超過24 h。（2）應(yīng)使用防止胰島貼壁黏附的培養(yǎng)瓶；應(yīng)按照20000 IEQ/175 cm2培養(yǎng)瓶計(jì)算所需培養(yǎng)瓶。（3）使用不含酚紅的0.5﹪HSA-CMRL 1066培養(yǎng)液。

10.胰島移植前制備：（1）移植前應(yīng)詳細(xì)核對供者、受者相關(guān)信息，準(zhǔn)確無誤后方可進(jìn)入移植程序。（2）詳細(xì)核對胰島的革蘭染色、細(xì)菌培養(yǎng)、真菌培養(yǎng)、支原體檢測、內(nèi)毒素檢測結(jié)果；尚無檢測報(bào)告的，應(yīng)立即和相關(guān)科室溝通，了解培養(yǎng)進(jìn)展程度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測的初步結(jié)果判斷是否進(jìn)入移植程序。（3）確定可以進(jìn)行移植后，觀察并初步判斷胰島生長情況，聯(lián)系臨床小組，確定是否可以移植。（4）胰島收集應(yīng)小心操作，盡可能減少離心次數(shù)。（5）及時(shí)采樣送檢進(jìn)行細(xì)菌革蘭染色鏡檢、內(nèi)毒素檢測、細(xì)菌培養(yǎng)、真菌培養(yǎng)、支原體檢測。待革蘭染色鏡檢和內(nèi)毒素檢測結(jié)果為陰性時(shí)，方可送達(dá)手術(shù)室進(jìn)行臨床移植。

11.臨床移植用胰島標(biāo)準(zhǔn)：（1）胰島細(xì)胞活性：即細(xì)胞膜的完整性，合格的胰島制品其活性應(yīng)≥70﹪。（2）胰島細(xì)胞純度：合格制品的純度應(yīng)≥30﹪。（3）胰島得率：數(shù)量達(dá)到≥6000 IEQ/kg受者體重。（4）細(xì)菌革蘭染色：陰性，即顯微鏡未檢出細(xì)菌真菌。（5）內(nèi)毒素檢測：合格的胰島制品是其體積與受者體重之比應(yīng)≤5 EU/kg。（6）細(xì)菌培養(yǎng)：陰性，即胰島制品在血瓊脂平板上培養(yǎng)3 d均未見細(xì)菌生長。（7）真菌培養(yǎng)：陰性，即胰島制品在沙堡勞瓊脂平板上培養(yǎng)7 d均未見菌落生長。（8）支原體檢測：包括支原體培養(yǎng)和DNA檢測，合格的胰島制品均為陰性。培養(yǎng)結(jié)果陰性表示胰島制品在支原體專用培養(yǎng)液中培養(yǎng)21d均未見生長，DNA檢測陰性表示未檢測出。（9）胰島素刺激指數(shù)：分離純化后的胰島，經(jīng)高、低兩種濃度的葡萄糖刺激后，其胰島素含量的比值，即為胰島素刺激指數(shù)。合格的胰島制劑應(yīng)在3.0以上。

1 邊旭明，朱寶生，劉俊濤，等.胎兒常見染色體異常與開放性神經(jīng)管缺陷的產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn).第1部分：中孕期母血清學(xué)產(chǎn)前篩查[J/CD].中國產(chǎn)前診斷雜志（電子版）.2011,3(3)：42-47.

2 邊旭明，朱寶生，劉俊濤，等.胎兒常見染色體異常與開放性神經(jīng)管缺陷的產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn).第2部分：胎兒染色體異常的細(xì)胞遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[J/CD].中國產(chǎn)前診斷雜志（電子版）.2011,3(4)：46-59.

附錄A

（資料性附錄）

成人胰島細(xì)胞分離、純化、培養(yǎng)及移植前制備流程圖附錄B

（資料性附錄）

成人胰島細(xì)胞分離、純化、培養(yǎng)及移植前制備操作程序

一、胰腺的修剪、清洗和插管

（一）胰腺的修剪

1.在BSC內(nèi)，應(yīng)用無菌技術(shù)打開裝有胰腺的運(yùn)送罐，取樣送檢進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)、真菌培養(yǎng)、支原體檢測、內(nèi)毒素檢測、革蘭染色鏡檢等。

2.在含有Eurocollins液（3.57﹪葡萄糖液）的冰水浴方盤中，觀察并記錄胰腺的外觀，包括脂肪量的多少、水腫、充血、軟硬程度等，是否附有十二指腸和(或)脾臟，胰腺是否有損傷。應(yīng)使用器械鈍性分離胰腺，小心去除胰腺上的結(jié)締組織和脂肪，以免損傷胰腺，破壞胰腺外膜的完整性，導(dǎo)致在擴(kuò)張過程中出現(xiàn)滲漏。

（二）胰腺的清洗

1.將胰腺分別經(jīng)1﹪聚維酮碘-Hanks液、抗生素液消毒，并用1×HBSS清洗3次，期間更換燒杯。

2.將胰腺放入不銹鋼運(yùn)送罐內(nèi)，稱重并記錄。將胰腺移至盛有威斯康星大學(xué)溶液（UWS）的冰水浴方盤中，稱重空的不銹鋼運(yùn)送罐及燒杯并記錄。

3.胰腺的插管：用手術(shù)刀從頭體結(jié)合部將胰腺切成兩部分，分別從胰總管插入靜脈留置管（16G或18G），用線固定后，取出內(nèi)芯。

二、胰腺的灌注

1.將胰腺移至另一潔凈冰水浴方盤中，加入新鮮配制的Liberase-Hank液350ml。用50ml注射器吸取酶液，向胰腺內(nèi)注入酶液。

2.灌注結(jié)束后，清除并稱量剔除的組織、縫線和套管等非胰腺組織，計(jì)算消化過程中胰腺的真實(shí)重量并記錄。

3.用手術(shù)刀將胰腺切成7～9塊，放入Recordi消化罐中，放入彈珠，并加入剩余酶液，直到液面到達(dá)放置濾網(wǎng)的平面處。放置濾網(wǎng)，蓋上蓋子，擰緊螺絲，確保密封沒有漏液。

4.取一個250ml離心管，加入100～150ml的Hank液。

三、胰腺的消化

1.打開蠕動泵，流速調(diào)整為150ml/min，將剩余的酶液泵入循環(huán)回路中，再將250ml離心管中的Hank液泵入循環(huán)回路，讓Hank液完全充滿循環(huán)回路，并排除其中的氣泡。

2.確定循環(huán)回路沒有滲漏后，裝好溫度監(jiān)控探針，將加熱彎管放入45℃水浴箱中，并觀察和記錄此時(shí)消化罐內(nèi)的溫度。

3.振蕩消化罐，開始計(jì)時(shí)。根據(jù)胰腺大小、時(shí)間和溫度調(diào)整振蕩的力度、頻率，開始時(shí)速度可適當(dāng)緩慢，并隨時(shí)觀察罐內(nèi)溫度。當(dāng)溫度達(dá)到37℃時(shí)，將加熱彎管取出，放入37℃水浴箱，并記錄時(shí)間。

4.消化一定時(shí)間后，取樣，加入雙硫腙染液，在顯微鏡下觀察判斷消化進(jìn)程。此后每間隔2min取樣一次，記錄所有觀察結(jié)果。

5.當(dāng)觀察到消化終點(diǎn)時(shí)，立即中止消化開始稀釋過程，并記錄消化過程中時(shí)間、溫度和觀察結(jié)果。

四、稀釋、收集消化產(chǎn)物

1.在消化的同時(shí)，準(zhǔn)備稀釋過程所需的試劑和收集容器。用250ml離心管收集消化產(chǎn)物，并預(yù)先加入適量RPMI 1640稀釋液（含HEPES），放入4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.消化終止后，迅速從水浴箱中取出加熱彎管，關(guān)閉泵并停止振蕩消化罐，調(diào)節(jié)泵速為300ml/min，開啟蠕動泵，將冷稀釋液導(dǎo)入罐內(nèi)，開始收集消化產(chǎn)物至250ml離心管中。收集時(shí)應(yīng)多人配合，離心管收集滿后，立即蓋緊蓋子，4℃、280×g離心 1min。

3.離心結(jié)束后，在另一個BSC內(nèi)，去上清，并保留少量的液體，小心重懸沉淀。合并4～5個離心管的沉淀至1個離心管中，重懸該沉淀，4℃、280×g離心洗滌1min。重復(fù)上述離心洗滌1次。

4.稱量未被消化的胰腺重量并記錄。

5.將所有組織收集在2個離心管中，用1ml移液管吸取100μl樣本進(jìn)行梯度離心前的細(xì)胞計(jì)數(shù)。

6.根據(jù)純化操作步驟的不同，選擇不同的試劑重懸組織：(1)若采用連續(xù)性梯度密度離心法進(jìn)行純化，則加入U(xiǎn)WS重懸組織，使其終體積為100ml。(2)若采用不連續(xù)梯度密度離心法進(jìn)行純化，則加入100ml Eurocollins液重懸組織。

7.組織重懸后，將離心管放置于冰浴中靜置30min。

五、胰島的純化

（一）連續(xù)性梯度密度離心法

1.檢查COBE儀電源，檢測儀器是否運(yùn)轉(zhuǎn)正常。將COBE袋小心裝入COBE儀中，關(guān)上離心機(jī)玻璃蓋及其附屬設(shè)備。用止血鉗在 “T”處附近夾住4路管子，留下1路管子保持開放。

2.在BSC內(nèi)準(zhǔn)備好梯度形成儀和磁力攪拌器，用連接管連接COBE袋和梯度形成儀，連接管通過蠕動泵并用止血鉗夾住。

3.在梯度形成儀中加入150ml 1.100 Ficoll液，開啟蠕動泵，將液體泵入COBE袋中，并排除COBE袋中的氣體，關(guān)閉蠕動泵。

4.在梯度形成儀的兩個杯子中分別加入120ml 1.100 Ficoll液和130ml 1.077的Ficoll液。

5.啟動COBE儀，打開磁力攪拌器，調(diào)整好轉(zhuǎn)速。啟動蠕動泵，并同時(shí)打開夾子或開關(guān)，此時(shí)液體會被泵入COBE袋。

6.同時(shí)準(zhǔn)備30～35個50ml離心管，分別編號，加入30ml洗液，備用。

7.待液體全部流完，立即加入已充分混懸的組織懸液，將組織液泵入COBE袋。

8.加載 20ml含酚紅的 1×HBSS，吸入空氣約1英寸后，再加載20ml 1×HBSS。

9.待液體全部泵入COBE袋，關(guān)閉蠕動泵，壓 “SUPER OUT”鍵，離心半徑9 cm，2400 r/min運(yùn)轉(zhuǎn)5min。

10.取下連接管，調(diào)整 “SUPER OUT VOLUME”為100ml/min，開始收集液體。

棄去最先收集的50ml液體，用已準(zhǔn)備好的離心管連續(xù)收集液體，每瓶收集20ml液體，混勻，并在每管中取樣，用雙硫腙染液鑒定胰島細(xì)胞的純度。

11.420×g、4℃離心 1min，去上清。加入適量洗液重懸，280×g、4℃離心1min，去上清。重復(fù)離心洗滌1次。

12.將需保留的離心管合并，并取樣計(jì)數(shù)。

13.取出COBE袋，在BSC內(nèi)取樣，經(jīng)雙硫腙染液染色后在顯微鏡下觀察是否含有胰島。若有較多數(shù)量的游離胰島，用離心管收集沉淀，并用洗液洗滌2次，進(jìn)行補(bǔ)救性純化過程（見五（三）部分）。

（二）不連續(xù)梯度密度離心法

1.按上述操作準(zhǔn)備好COBE儀和梯度形成儀，將靜止已分層的胰島組織液去上清，加入300ml Ficoll儲存液（密度為1.132）重懸。

2.將組織懸液通過50ml注射器轉(zhuǎn)移至1個600ml的轉(zhuǎn)移袋中，用少量Ficoll儲存液清洗離心管，封閉轉(zhuǎn)移袋。

3.將轉(zhuǎn)移袋掛在COBE儀上方的金屬桿上，并和COBE袋連接，使組織流入COBE袋中。

4.同時(shí)準(zhǔn)備4個裝有125ml洗液的250ml離心管收集液體，并標(biāo)記。

5.組織懸液完全進(jìn)入COBE袋后，關(guān)閉夾子，打開和梯度形成儀相通硅管，將Eurocollins-Ficoll分離液（1.108）泵入連接管，關(guān)閉夾子。

6.打開和轉(zhuǎn)移袋相通管子，完成排除COBE袋中空氣操作。

7.調(diào)整速度為2000 r/min，離心半徑9 cm，啟動COBE儀平穩(wěn)后，打開和梯度形成儀相連的硅管，啟動蠕動泵，將密度為1.108、1.096、1.037的Eurocollins-Ficoll分離液各75ml，按順序泵入COBE袋中。

8.待液體全部泵入COBE袋，關(guān)閉蠕動泵，壓 “SUPER OUT”鍵。COBE儀運(yùn)轉(zhuǎn)3min。

9.離心結(jié)束后，小心取下連接管，調(diào)整“SUPER OUT VOLUME”為100ml/min，開始收集液體。收集好各部分后，關(guān)閉COBE儀。

10.各管取樣計(jì)數(shù)，420×g、4℃離心 1min，去上清。加入適量洗液重懸組織，280×g、4℃離心1min，去上清。重復(fù)洗滌1次。

11.將需保留的離心管合并，并取樣計(jì)數(shù)。

12.取出COBE袋，在生物安全柜內(nèi)取樣，經(jīng)雙硫腙染液染色后在顯微鏡下觀察是否含有胰島。若有較多數(shù)量的游離胰島，用離心管收集沉淀，并用洗液洗滌2次，進(jìn)行補(bǔ)救性純化過程（見五（三）部分）。

（三）補(bǔ)救措施（不連續(xù)梯度密度離心法）

1.初次分離純化（連續(xù)或不連續(xù)梯度密度離心法）后，應(yīng)檢查COBE袋沉淀中胰島數(shù)量。若發(fā)現(xiàn)仍殘留較多的胰島，則應(yīng)該采用補(bǔ)救性純化方式避免胰島的丟失。

2.合并所有的組織，洗滌沉淀3次（4℃、1000 r/min離心1min），去除殘留的Ficoll液，沉淀加入300ml Eurocollins溶液重懸，置于4 ℃孵育45min，并按照不連續(xù)梯度密度離心法在COBE儀上再次重復(fù)純化過程（見五（三）部分）。

3.完成補(bǔ)救性純化過程后，用CMRL 1066培養(yǎng)液重懸最后的沉淀，混勻。取樣進(jìn)行胰島計(jì)數(shù)。

六、胰島計(jì)數(shù)和純度評估

（一）胰島計(jì)數(shù)

1.由于胰島細(xì)胞團(tuán)易發(fā)生沉淀，取樣前必須徹底混懸胰島，使取樣具有代表性。

2.用移液管取樣100μl，移入35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿或24孔培養(yǎng)板中，加入雙硫腙染液1min后，在帶標(biāo)尺的顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)胰島。

3.胰島染色后呈紅色，其它細(xì)胞不顯色。直徑≥50 μm的胰島才列入計(jì)數(shù)范圍，根據(jù)胰島直徑大小分類，計(jì)數(shù)每組胰島的數(shù)量，并記錄。

4.根據(jù)胰島數(shù)量和稀釋倍數(shù)，計(jì)算出實(shí)際的胰島數(shù)（IPN）、胰島當(dāng)量（IEQ）。

（二）胰島的純度百分比和包裹胰島細(xì)胞的百分比

1.顯微鏡下，通過估計(jì)呈紅色的胰島細(xì)胞數(shù)量和沒有染上紅色的腺泡細(xì)胞（棕色）數(shù)量，來評估胰島細(xì)胞的純度百分比。

2.根據(jù)胰島細(xì)胞的純度百分比計(jì)算胰島的平均純度，估算被腺泡細(xì)胞包裹的胰島與游離胰島的百分比。

七、胰島培養(yǎng)

（一）培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法

1.用0.5﹪HSA的CMRL 1066培養(yǎng)液重懸胰島，分裝各瓶，37℃、5﹪CO2條件培養(yǎng)。胰島細(xì)胞在分配到培養(yǎng)瓶前取上清液進(jìn)行無菌檢測。

2.取培養(yǎng)過夜的胰島樣本進(jìn)行細(xì)胞活力和葡萄糖刺激指數(shù)的檢測（見八部分)。

3.胰島接種密度為：20000 IEQ胰島/175ml培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)液30ml。培養(yǎng)前要仔細(xì)檢查培養(yǎng)瓶是否有裂縫，培養(yǎng)結(jié)束后、移植前要檢測胰島是否被污染。胰島在移植前24 h培養(yǎng)溫度為37℃，然后移至22℃再培養(yǎng)24～48h。

（二）培養(yǎng)袋培養(yǎng)法：在胰島加入培養(yǎng)袋（3 L）前，應(yīng)先計(jì)算每袋胰島的最大培養(yǎng)量。當(dāng)胰島純度> 70﹪，按每個培養(yǎng)袋中最多加入200000 IEQ的胰島計(jì)算；當(dāng)胰島純度< 70﹪，按每個培養(yǎng)袋中最多可加入100000 IEQ的胰島，培養(yǎng)液的終體積為550ml。標(biāo)記好培養(yǎng)袋后，將胰島細(xì)胞和培養(yǎng)液裝入袋中，然后熱封培養(yǎng)袋，去除所有管路。按上述溫度要求進(jìn)行培養(yǎng)。

八、胰島素刺激指數(shù)檢測

1.胰島分離純化后，根據(jù)胰島計(jì)數(shù)結(jié)果用無菌技術(shù)吸取大約400個胰島。

2.配制含有0.5﹪HSA的CMRL 1066培養(yǎng)基培養(yǎng)胰島細(xì)胞。

3.在BSC內(nèi)，將胰島細(xì)胞移入一直徑為100 mm的帶蓋細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，加入15ml培養(yǎng)基，正確標(biāo)注并合上蓋子，放入37℃、5﹪CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h。

4.準(zhǔn)備葡萄糖刺激試驗(yàn)相關(guān)試劑：（1）25.0mmol/L葡萄糖溶液（高濃度）：在50ml的無糖RPMI 1640貯存液中，溶解0.439 g葡萄糖，再加入剩余的50ml貯存液，使葡萄糖的終濃度為25.0mmol/L，用1 N NaOH或HCl溶液調(diào)整pH值，0.22 μm過濾，標(biāo)記后，置于4℃冰箱可保存10d。（2）2.8mmol/L葡萄糖溶液（低濃度）：0.250 g葡萄糖溶解于100ml無糖RPMI 1640貯存液中，再加入剩余的400ml貯存液，使葡萄糖的終濃度為2.8mmol/L，調(diào)節(jié)pH值，過濾，標(biāo)記，放入2～8℃冰箱可保存10d。

5.胰島細(xì)胞的靜止培養(yǎng)和葡萄糖刺激：（1）預(yù)先在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的2個孔內(nèi)分別滴入1200μl 2.8mmol/L的低濃度葡萄糖溶液，并標(biāo)記 “L1”和“L2”；另2孔內(nèi)分別滴入1200μl 25mmol/L的高濃度葡萄糖溶液，標(biāo)記 “H1”和“H2”。（2）將培養(yǎng)板放入恒溫培養(yǎng)箱，使培養(yǎng)板的溫度達(dá)到37℃。（3）取2個帶蓋細(xì)胞培養(yǎng)皿，并注明 “1”和“2”，在每個培養(yǎng)皿內(nèi)加入15ml低濃度葡萄糖溶液。（4）將過夜培養(yǎng)的250～400個胰島細(xì)胞重懸于≤100μl的培養(yǎng)液，并轉(zhuǎn)移至標(biāo)注為 “1”的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕混勻洗滌。（5）等稍微沉淀后，將“1”中的所有胰島用≤100μl的液體，轉(zhuǎn)移至標(biāo)注為 “2”的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，混懸，靜止5min。

6.旋轉(zhuǎn) “2”細(xì)胞培養(yǎng)板以聚集胰島細(xì)胞，用≤100μl的體積，將胰島細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 “細(xì)胞”試管內(nèi)。在試管內(nèi)加入低濃度葡萄糖溶液，使體積達(dá)到試驗(yàn)所需的總體積。

7.在細(xì)胞培養(yǎng)板的 “L1”孔內(nèi)加入300μl胰島細(xì)胞懸液，使孔內(nèi)溶液總體積達(dá)到1500μl。按上述操作將胰島細(xì)胞加入各孔中。

8.蓋上蓋子，將細(xì)胞培養(yǎng)板放在37℃、5﹪CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2h。

9.培養(yǎng)結(jié)束后，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，讓胰島細(xì)胞在室溫下自然沉淀5min。

10.小心地從每個孔中吸取800μl上清液，并分別加入事先做好標(biāo)記的試管內(nèi)，置于冰浴上。

11.4℃、200～300 rpm離心試管3min，小心吸取700μl上清液，加入2ml凍存管內(nèi)，用ELISA方法檢測人胰島素的含量。如果檢測不能馬上進(jìn)行的話，應(yīng)冷凍保存（-20℃或更低）。

12.將檢測所得的高糖刺激孔的胰島素含量除以低糖刺激孔，得到胰島素刺激指數(shù)。

九、胰島移植前制備

1.仔細(xì)核對胰腺供體與胰島移植受者詳細(xì)資料，包括姓名、年齡、性別、ABO血型、Rh血型、巨細(xì)胞病毒（CMV）檢測結(jié)果、移植日期，核對受者體重（kg）、供受者HLA配型結(jié)果。

2.準(zhǔn)備好移植前制備所需試劑和耗材，小心取出培養(yǎng)后的胰島，在顯微鏡下觀察每個培養(yǎng)瓶中有無污染，同時(shí)校驗(yàn)細(xì)菌、真菌、內(nèi)毒素的檢測報(bào)告。

3.在BSC內(nèi)，分別集中所有的胰島細(xì)胞至不同的250ml離心管中，并置于離心管架靜止30min。小心取樣上清液，送檢分別進(jìn)行細(xì)菌革蘭染色鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)、真菌培養(yǎng)、支原體檢測、內(nèi)毒素檢測。

4.小心收集離心管內(nèi)上清液，留少量上清，備用。將所有上清液都集中到另外的離心管中，并用移植培養(yǎng)液洗滌培養(yǎng)瓶，共3次（至所有胰島被洗滌下來）。

5.將洗滌液和上述上清液合并，常溫下280×g離心1min。吸取上清至另外離心管，并保留30～40ml溶液。將第2次上清再次離心，在新的上清取樣，觀察是否存在胰島細(xì)胞。如果確認(rèn)沒有胰島細(xì)胞的存在，就丟棄上清液。如果有，繼續(xù)離心沉淀。

6.將所有沉淀混合在同一離心管中，常溫下280×g離心 1min，棄上清。

7.準(zhǔn)確定量總體積并用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，采樣后進(jìn)行胰島細(xì)胞計(jì)數(shù)和純度評估。

8.在準(zhǔn)備好的胰島移植袋上作好標(biāo)注，并請第2人核實(shí)。

9.在150ml小袋內(nèi)通過連接管加入50ml移植培養(yǎng)基，小心排出袋內(nèi)全部氣體。將準(zhǔn)備好的胰島制品通過注射器轉(zhuǎn)入600ml轉(zhuǎn)移袋內(nèi)，并用20ml移植培養(yǎng)基沖洗滌離心管后，和肝素一并加入到600ml的轉(zhuǎn)移袋內(nèi)，排除氣體后，用止血鉗夾住耦合器。

10.將移植袋裝入無菌方盤，放入運(yùn)送箱后，送達(dá)移植手術(shù)室，移交給臨床移植組人員并簽字。