趙紅州 黃梁滸

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是來源于中胚層的具有自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞，幾乎存在于人體所有組織，最早從骨髓中分離得到[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs免疫原性弱，體外不誘發(fā)免疫應(yīng)答［4-6］，而且MSCs具有獨(dú)特的多譜系分化特性和天然的免疫抑制與調(diào)節(jié)功能，以及強(qiáng)大的組織修復(fù)能力［1］，凸顯其作為種子細(xì)胞應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)的潛能。實(shí)體器官移植是治療重要臟器功能衰竭的主要方法，而免疫抑制劑的廣泛使用提高了移植物的存活率，但同時(shí)也帶來感染增加、毒副作用強(qiáng)等不良后果[7]。MSCs作為免疫調(diào)節(jié)劑，通過抑制淋巴細(xì)胞增殖、抑制抗原呈遞細(xì)胞分化成熟而發(fā)揮其獨(dú)特的免疫抑制作用，使其在器官移植方面顯現(xiàn)出潛在優(yōu)勢(shì)和良好應(yīng)用前景[8-11]。但是由于MSCs廣泛存在，一方面在移植中MSCs不可避免地會(huì)曝露在免疫抑制藥物作用之下，使其免疫調(diào)理的作用受到影響[9，12]；另一方面MSCs表達(dá)多種免疫抑制劑的分子作用靶位，如鈣神經(jīng)素（calcineurin，CNI）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）和肌苷5'-磷酸脫氫酶（inosine 5'-monophosphate dehydrogenase，IMPDH），免疫抑制劑與其受體結(jié)合后作用于上述分子作用靶位，從而影響MSCs的生物學(xué)特性及其功能[13-15]。但兩者之間相互影響究竟如何以及二者相互作用的機(jī)制尚無定論，本文就這些方面研究作一綜述。

一、免疫抑制藥物對(duì)MSCs的影響

1.免疫抑制藥物對(duì)MSCs多向分化潛能的影響：體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，免疫抑制藥物可以影響MSCs誘導(dǎo)成成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞等的能力[1，16-20]。在MSCs培養(yǎng)體系中加入免疫抑制劑CNI類[環(huán)孢素A（cyclosporin A，CsA）與他克莫司]、霉酚酸（mycophenolic acid，MPA）和雷帕霉素共培養(yǎng)，免疫抑制劑基本不影響MSCs的免疫表型，而影響其向成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞分化的能力。在MSCs成骨、成脂誘導(dǎo)體系中分別加入不同濃度梯度的免疫抑制劑他克莫司（1，10，100 ng/ml）、MPA（1，10，100 μg/ml）、雷帕霉素（0.1，1，10，50 ng/ml）和CsA(10，100，500 ng/ml)。結(jié)果顯示成骨誘導(dǎo)體系對(duì)照組有明顯的鈣鹽礦物質(zhì)沉積，而加入不同濃度梯度MPA和他克莫司處理組鈣鹽沉積減少，尤其是加入MPA濃度在10 μg/ml時(shí)鈣鹽沉積減少最明顯，表明上述兩種免疫抑制劑抑制了MSCs向成骨細(xì)胞分化，而雷帕霉素對(duì)MSCs成骨分化的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與成骨誘導(dǎo)結(jié)果相反，在MSCs向成脂誘導(dǎo)分化時(shí)，雷帕霉素明顯增強(qiáng)了MSCs的成脂能力，而MPA和他克莫司對(duì)其成脂無明顯的影響[18-23]。

2.免疫抑制藥物對(duì)MSCs免疫調(diào)節(jié)作用的影響：Buron等[21]證實(shí)體外MSCs表達(dá)免疫抑制活性。在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系中，反應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì)胞皆來源于人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，加入第 三 方MSCs細(xì)胞做混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)果顯示MSCs以一種劑量和時(shí)間依賴的方式，而非MHC限制的方式抑制T淋巴細(xì)胞增值。研究發(fā)現(xiàn)在MSCs抑制T細(xì)胞增殖的分子機(jī)制中，與MSCs共培養(yǎng)的T細(xì)胞周期被抑制在G0/G1期，T細(xì)胞中促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)換的周期蛋白CyclinD2表達(dá)下調(diào)，而抑制細(xì)胞增殖的蛋白p27KiPl上調(diào)，MSCs 的這種調(diào)節(jié)作用并不是針對(duì)T細(xì)胞某個(gè)亞群，而是抑制所有種類的 T 細(xì)胞增殖[17，23-28]。

在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系中將作為第三方的MSCs與PBMC來源的反應(yīng)細(xì)胞以終濃度分別為1:20、1:10和1:5之比例混合，并加入不同濃度梯度的免疫抑制劑（含正常血藥濃度）共培養(yǎng)。結(jié)果表明當(dāng)兩者比值為1:20時(shí)，MSCs對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用有限，淋巴細(xì)胞增殖被抑制的程度不足50﹪，然而CsA、MPA、他克莫司和雷帕霉素等免疫抑制劑都隨著藥物濃度增加以劑量依賴的方式增強(qiáng)MSCs對(duì)T細(xì)胞的免疫抑制效應(yīng)；然而MSCs與反應(yīng)細(xì)胞比值為1:10和1:5時(shí)，MSCs自身就成了一種強(qiáng)免疫抑制劑，對(duì)淋巴細(xì)胞增殖起到抑制作用，這種情形下藥物對(duì)MSCs作用表現(xiàn)出多樣性：（1）CsA出現(xiàn)拮抗MSCs抑制效應(yīng)的現(xiàn)象，兩者比值1:10時(shí)，在無免疫抑制劑存在的情況下MSCs自身抑制80﹪的淋巴細(xì)胞增殖，使得淋巴細(xì)胞增殖水平只有對(duì)照組的20﹪，然而在加入10 ng/ml或100 ng/ml CsA后MSCs對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用減弱，淋巴細(xì)胞增殖水平為對(duì)照組的40﹪，MSCs與反應(yīng)細(xì)胞比值1:5時(shí)一樣；（2）他克莫司、雷帕霉素對(duì)MSCs的作用類似CsA；（3）MPA促進(jìn)MSCs抑制作用，MSCs與反應(yīng)細(xì)胞比值1:10或1:5時(shí)，MPA隨著劑量的增加對(duì)MSCs表現(xiàn)出協(xié)同作用，促進(jìn)其抑制增殖作用［18，29］。

3.免疫抑制藥物對(duì)MSCs細(xì)胞活性的影響：MSCs 5000/孔種植于96孔板，分別加入1，10，100 ng/ml他克莫司，1，10，100 μg/mlMPA，0.1，1，10，50 ng/ml雷帕霉素，在標(biāo)準(zhǔn)條件下共培養(yǎng)24 h和7 d，用MTT法檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)24 h內(nèi)幾種藥物對(duì)MSCs存活幾乎無影響；當(dāng)MSCs與上述藥物共培養(yǎng)了7 d后，觀察結(jié)果提示他克莫司在濃度100 ng/ml時(shí)能顯著降低MSCs活細(xì)胞數(shù)量，而MPA在濃度100 μg/ml時(shí)也能夠降低MSCs的活細(xì)胞數(shù)量，但程度比他克莫司弱的多[21-23，30]。

MSCs以2×105/孔種植于6孔板，分別加入10 ng/ml他克莫司、10 μg/ml MPA、10 ng/ml雷帕霉素，不加藥物組作為對(duì)照均在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，分別培養(yǎng)至第48小時(shí)和第7天，胰酶消化，收集細(xì)胞，使用凋亡檢測(cè)試劑盒annexin V染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞比值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種藥物分別對(duì)MSCs凋亡的影響與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[30-32]。

4.免疫抑制藥物對(duì)MSCs細(xì)胞增殖的影響：MSCs以103/孔種植于96孔板，在MSCs培養(yǎng)體系分別加入上述不同濃度免疫抑制藥物，以培養(yǎng)到第3天和第7天作為觀察時(shí)間點(diǎn)。在觀察前12h分別摻入0.5 uCi /孔3H-胸腺嘧啶脫氧核苷，以閃爍計(jì)數(shù)儀對(duì)增殖細(xì)胞分別定量測(cè)定MSCs的增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)他克莫司對(duì)MSCs的增殖影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3種不同濃度的MPA均能顯著降低MSCs增殖能力，第3天測(cè)定時(shí)在濃度10 μg/ml時(shí)MSCs增殖能力降低最明顯，降低了90﹪，第7天時(shí)結(jié)果相似；雷帕霉素則以一種劑量依賴的方式影響MSCs增殖，其濃度大于10 ng/ml時(shí)能顯著降低MSCs增殖[32-34]。

二、MSCs對(duì)免疫抑制藥物的影響

MSCs在達(dá)到一定的濃度時(shí)，也表現(xiàn)出強(qiáng)的免疫抑制活性[9-10，22]。Bartholomew 等[35]對(duì)進(jìn)行皮膚移植的狒狒輸注供者狒狒的MSCs，發(fā)現(xiàn)可延長(zhǎng)移植皮膚的存活時(shí)間，其效果可和環(huán)孢素媲美；即便是第三方來源的MSCs也有類似效果。對(duì)異體活體肝移植狗的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組僅做活體肝移植，處理組在活體肝移植的基礎(chǔ)上，經(jīng)門靜脈輸注自體骨髓 MSCs，輸注 MSCs組具有更長(zhǎng)的生存率(P < 0.001)，肝功能指標(biāo)更低 (P < 0.01)，但MSCs輸注組與對(duì)照組相比排斥反應(yīng)發(fā)生率相似。在腎移植等其他實(shí)體器官移植的試驗(yàn)中也有相關(guān)使用MSCs可減低排斥反應(yīng)發(fā)生率的報(bào)道。MSCs減輕實(shí)體器官移植排斥反應(yīng)的機(jī)制比較復(fù)雜，在心臟移植的動(dòng)物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，MSCs可移行至發(fā)生慢性排斥反應(yīng)的異體心臟，因此推測(cè)MSCs可能具有局部免疫抑制作用[33]。

由于MSCs具有免疫抑制活性，與免疫抑制藥物一同作用發(fā)揮免疫抑制活性時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)協(xié)同增強(qiáng)作用或拮抗作用，抑或相互無影響。在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，MSCs對(duì)低濃度的免疫抑制藥物的免疫抑制效應(yīng)有促進(jìn)作用；MSCs拮抗高濃度的CNI類免疫抑制劑的免疫抑制效應(yīng)，但是CsA在500 ng/ml工作濃度時(shí)，MSCs對(duì)其無影響；MSCs與MPA有協(xié)同效應(yīng)，MSCs能夠增強(qiáng)MPA對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)，在大鼠心臟移植試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，MSCs結(jié)合低劑量MPA，可誘導(dǎo)心臟異體移植后動(dòng)物的免疫耐受，試驗(yàn)組大鼠的移植心臟平均存活時(shí)間達(dá)100d以上，而對(duì)照組僅為13d。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，MSCs與MPA協(xié)同效應(yīng)與MPA濃度無相關(guān)性[22，31]。

三、MSCs免疫抑制活性的機(jī)制和MSCs與免疫制劑相互作用的可能機(jī)制

圖1 MSCs與其他免疫細(xì)胞的相互作用[30]

盡管靶細(xì)胞和MSCs通過直接接觸相互作用是MSCs發(fā)揮免疫抑制活性的一個(gè)重要因素，但細(xì)胞與細(xì)胞之間直接接觸并非必需。通過其他免疫細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子共同活化MSCs，誘導(dǎo)其分 泌 如 INF-γ、TGF-β、PGE-2、IL-10、TNF-α、IL-1、NO等多種可溶性炎癥因子從而發(fā)揮其免疫抑制活性被認(rèn)為是MSCs發(fā)揮其免疫抑制作用的主要機(jī)制（圖1）。低濃度IFN-γ可上調(diào)MSCs表面MHCⅡ類分子的表達(dá)，但隨著IFN-γ的水平升高，其Ⅱ類分子的表達(dá)量降低，其抗原提呈能力也逐漸下降。這使得MSCs在免疫反應(yīng)早期，IFN-γ水平較低時(shí)，表現(xiàn)為APC的功能，隨著IFN-γ水平的增高 ，MSCs的功能就轉(zhuǎn)化為免疫抑制了[23，28]。有文獻(xiàn)報(bào)道MSCs體外能調(diào)節(jié)B細(xì)胞、T細(xì)胞、DC細(xì)胞和NK細(xì)胞活性。T淋巴細(xì)胞是實(shí)體器官移植排異的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞。體外試驗(yàn)也表明MSCs對(duì)CD8+T淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞有抑制作用，MSCs體外可抑制T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th2方向分化，并可誘導(dǎo)出具有抑制功能的T細(xì)胞亞群，從而阻斷T細(xì)胞對(duì)刺激細(xì)胞的應(yīng)答，阻斷前體T細(xì)胞發(fā)育為CD8+T細(xì)胞，且抑制CD8+T細(xì)胞的殺傷功能，體內(nèi)抑制記憶性T細(xì)胞的增殖、細(xì)胞毒性反應(yīng)，以及抑制產(chǎn)生IFN-γ的T細(xì)胞數(shù)量等，但有關(guān)體內(nèi)MSCs對(duì)T淋巴細(xì)胞的影響，受目前資料所限尚無確切證據(jù)。樹突狀細(xì)胞（dendritic cells ，DC）在實(shí)體器官移植排斥反應(yīng)中起著重要作用，MSCs可以通過改變DC的成熟度，促進(jìn)其向調(diào)節(jié)性表型轉(zhuǎn)化，因此很有可能以此影響DC的功能，達(dá)到免疫抑制的作用。對(duì)小鼠和人類 MSCs的體外研究發(fā)現(xiàn)MSCs還可以抑制B淋巴細(xì)胞的增殖、分化和趨化作用，且這種作用至少部分地與可溶性因子有關(guān)，如INF-γ、TGF-β 等[23-28，36-38]。

研究證實(shí)，MSCs表達(dá)多種免疫抑制劑的分子作用靶位，如CNI、mTOR和IMPHD等。（1）CNI在MSCs和T細(xì)胞上都有表達(dá)，能夠活化T細(xì)胞并且在MSCs成骨、成軟骨分化過程中起重要作用，而他克莫司和CsA則是CNI的抑制劑，二者通過抑制CNI活性，破壞在T細(xì)胞活化方面起重要作用的細(xì)胞因子如IL-2、IL-4等基因的表達(dá)，從而阻斷T細(xì)胞活化，并抑制MSCs成骨、成軟骨分化；（2）mTOR是雷帕霉素的分子作用靶位，mTOR與雷帕霉素結(jié)合后能夠通過不同的細(xì)胞因子受體阻斷信號(hào)傳導(dǎo)，阻斷MSCs由G1期至S期的進(jìn)程，在MSCs增殖、分化和存活等過程中起到重要作用；（3）作為細(xì)胞周期阻斷劑的活性代謝產(chǎn)物之一的MPA，其分子作用靶位為IMPHD，而且發(fā)現(xiàn)MPA能夠顯著抑制MSCs增殖，其可能機(jī)制是：IMPHDⅡ亞型僅表達(dá)于活化的淋巴細(xì)胞和MSCs，而且MSCs高表達(dá)Ⅱ亞型，其他細(xì)胞則只表達(dá)IMPHD Ⅰ亞型，有文獻(xiàn)報(bào)道MPA與IMPHD Ⅱ亞型的親和力顯著強(qiáng)于IMPHD I亞型，因此MPA對(duì)Ⅱ亞型的抑制作用也強(qiáng)于Ⅰ亞型，MPA對(duì)MSCs則表現(xiàn)為顯著抑制其增殖、分化[21-24，38]。綜上所述，免疫抑制劑通過與MSCs上表達(dá)的多種免疫抑制劑的分子作用靶位相結(jié)合，從而發(fā)揮其免疫抑制效應(yīng)，這可能就是免疫抑制劑抑制MSCs增殖、分化和影響MSCs細(xì)胞周期的一種機(jī)制。

目前免疫抑制劑與MSCs兩者相互作用機(jī)制尚無定論，但目前存在一個(gè)得到多數(shù)研究人員認(rèn)可的假說：CNI類抑制淋巴細(xì)胞的活化和炎癥因子的釋放，這些炎癥因子尤其是IFN-γ和炎性微環(huán)境是MSCs發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)必須的，因此，CNI類通過抑制其他免疫細(xì)胞釋放MSCs活化必須的炎癥因子和抑制炎性微環(huán)境，從而表現(xiàn)出抑制MSCs活化、增殖、分化和存活的效應(yīng)[21-24，29]。MSCs分泌釋放INF-γ、TGF-β、IL-10 等可溶性炎癥因子，在與免疫抑制劑一同作用時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)協(xié)同增強(qiáng)作用或拮抗作用。

四、總結(jié)與展望

由于MSCs的免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)性，使其成為有良好應(yīng)用前景的器官移植治療新手段。而且在骨髓移植中還發(fā)現(xiàn)同源性MSCs能促進(jìn)移植物植入和降低移植排斥的發(fā)生，異源性MSCs阻礙移植物植入[39]。雖然目前MSCs的相關(guān)研究結(jié)果令人鼓舞，但仍有大量問題無法回避：（1）MSCs的來源：盡管源于骨髓、脂肪、臍帶等的 MSCs功能相似，但不同來源的MSCs其某些CD分子表達(dá)不完全一致，且脂肪來源的MSCs在傳代過程中相對(duì)容易出現(xiàn)染色體改變[40-41]；（2）干細(xì)胞的定位和作用機(jī)制仍然不清楚，干細(xì)胞進(jìn)入血循環(huán)后，如何通過腎小球基底膜屏障到達(dá)靶部位進(jìn)行分化和修復(fù)，也是亟待解決的問題[42]；（3）在實(shí)體器官移植中免疫抑制劑和MSCs相互影響，有的與MSCs表現(xiàn)協(xié)同作用，而有的與MSCs相互拮抗，兩者之間的作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明，如何用藥、如何規(guī)避風(fēng)險(xiǎn)提高移植器官存活率等尚無統(tǒng)一的觀點(diǎn)。盡管如此，關(guān)于MSCs的研究目前已然成為臨床熱點(diǎn)。隨著基礎(chǔ)研究的深入及臨床試驗(yàn)資料的不斷完善，MSCs作為一種新的免疫調(diào)節(jié)劑展現(xiàn)良好的應(yīng)用前景，將可能成為一種理想的細(xì)胞治療手段。

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