董維平 王煜非 彭永德

大量實驗研究證明，胰島移植不僅能糾正糖尿病動物的代謝異常，還能防止微血管病變，是治療1型糖尿病的理想方法[1]。胰島移植手術簡便安全，但由于存在免疫性排斥，胰島移植常需使用大量免疫抑制藥物，從而限制了臨床應用。如果能夠通過對胰島細胞的預處理，降低移植物的免疫原性，將有助于胰島細胞的存活，并減少免疫抑制藥物的應用，有利于胰島移植的臨床推廣。本研究采用24℃培養(yǎng)、冷凍保存、中波紫外線照射和抗主要組織相容性復合物（major histocompatibility complex，MHC）Ⅱ類抗原單克隆抗體等方法對胰島進行預處理。以胰島-淋巴細胞混合培養(yǎng)(mixed islet lymphocyte culture,MILC)、抗豬白細胞抗原（swine leukocyte antigen，SLA）-DR單抗免疫組化染色陽性細胞和淋巴細胞數(shù)量比較各組胰島的免疫原性，以胰島素釋放試驗比較胰島的功能，比較各種體外預處理對胰島細胞免疫原性和功能的影響，選擇既能降低胰島細胞的免疫原性，又不影響胰島功能的預處理方法。

材料與方法

一、儀器與材料

選用1～3日齡雜種豬作為實驗動物。準分子激光儀為波長308 nm，20 mj/脈沖 （中科院上海光機所準分子激光研究室研制）。

膠原酶P(瑞士Roche公司)，新生牛血清（newborn calf serum,NCS）、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、RPMI 1640培養(yǎng)液（美國GIBCO公司），抗MHCⅡ類抗原單抗(美國VMRD公司)，SLA-DR單抗(美國Pharmingen公司)，ABC免疫組化試劑盒(美國Vector公司)。

二、方法

（一）膠原酶溶液的配制

于100ml Hank液中加入固體氯化鈣82.5 mg (7.5mmol/L)，HEPES 238 mg(10mmol/L)，完全溶解后用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH到7.8，加50 mg膠原酶P，完全溶解后以0.2 μm孔徑的針頭濾器過濾除菌。

（二）胰島細胞制備

新生豬經(jīng)消毒后，剖腹取胰，于冷Hank液中剪碎(< 1mm3)，加冷 Hank 液 50ml，4℃，200×g離心2min，棄上清液，每立方厘米胰腺碎片加膠原酶溶液10ml，于38℃水浴振蕩消化8min，吸取上層已分離的細胞懸液，沉淀加膠原酶液再消化8min，用吸管吹打后加含10﹪NCS的冷Hank液終止消化，4℃，200×g離心 2min，棄上清液，用Hank液洗滌2次，加含20﹪FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。

（三）分組

A組（24℃組）：于含20﹪FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，5﹪CO2培養(yǎng)箱24℃培養(yǎng)5 d。B組（凍存組）：胰島細胞于5﹪CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)2 d，收集胰島樣細胞團(islet-like cell cluters,ICCs)于2ml凍存管，加含10﹪DMSO、20﹪FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，4℃平衡30min，以0.3℃/min速率降溫到-80℃，投入液氮中，保存2 d后38℃恒溫水浴解凍，冷Hank液倍比稀釋透出DMSO，冷Hank液洗滌，加含20﹪FBS的1640培養(yǎng)2 d。C組（激光組）：將培養(yǎng)2 d的ICCs混懸于1640培養(yǎng)液，置5.5 mm培養(yǎng)皿中，中波(308 nm)準分子激光，20 mj/脈沖，1200次，37℃再培養(yǎng)2 d。D組（抗體組）：于培養(yǎng)2 d的ICCs培養(yǎng)液中加抗MHCⅡ類抗原單抗(0.5﹪終濃度)，37℃孵育2 d。E組（對照組）：5﹪CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)5 d 。

（四）免疫原性檢測

1.胰島-淋巴細胞混合培養(yǎng)(MILC)：Wistar大鼠心內(nèi)穿刺采血10ml，用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，置1640培養(yǎng)液，調(diào)整細胞至1×106/ml，加入96孔U型底培養(yǎng)板，每孔0.1ml，另分別加各組ICCs 10個/ 0.1ml，每份樣品3個復孔；同時作單純淋巴細胞培養(yǎng)(空白對照)。37℃培養(yǎng) 4 d 后，各孔加 3H-Tdr 1 μCi，再培養(yǎng) 18h，收集細胞于玻璃纖維濾膜上，加液態(tài)閃爍體后測cpm值(美國Beckman公司3800型液閃測定儀)。取3個復本的中位數(shù)，按下述公式計算刺激指數(shù)(stimulating index,SI)：SI=各實驗組cpm /空白對照cpm。

2.胰島細胞內(nèi)MHCⅡ類抗原細胞檢測：各組ICCs經(jīng)OCT包埋，冰凍切片，用抗SLA-DR單抗免疫組化染色(ABC法)，蘇木素復染，計數(shù)有核陽性細胞數(shù)，每個樣本計數(shù)4個高倍視野，以陽性細胞的平均百分率(﹪)表示。

3.胰島內(nèi)淋巴樣細胞計數(shù)：各組ICCs經(jīng)OCT包埋，冰凍切片，HE染色，每個樣本計數(shù)4個高倍視野內(nèi)淋巴樣細胞數(shù)，以平均每個高倍視野的淋巴樣細胞數(shù)表示。

（五）胰島功能檢查

以胰島素釋放試驗比較胰島的功能，收集各組ICCs，離心沉淀，Hank液洗2次，計數(shù)，取250個ICCs，各加Hank液1ml(含2.8mmol/L葡萄糖)，37℃培養(yǎng)2h，吸取上清液送測胰島素。再加高糖Hank液1ml(含16.7mmol/L葡萄糖，10mmol/L茶堿)，37℃培養(yǎng)2h，吸取上清液送測胰島素。以胰島素釋放指數(shù)(高糖胰島素釋放量/低糖胰島素釋放量)作為胰島細胞功能鑒定的指標。

(六)統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件處理，胰島細胞免疫原性檢測指數(shù)（SI刺激指數(shù),DR+細胞數(shù)、淋巴樣細胞數(shù)）及胰島素釋放結(jié)果及釋放指數(shù)以表示 ；以上指標 A、B、C、D、對照組間的差異采用單因素方差分析（ANOVA），組間比較采用LSD法，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、MILC

預處理各組ICCs的SI值分別為2.2±0.8、1.8±0.6、2.0±1.5、2.1±1.0 和7.4±2.3，各組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=30.398，P=0.01，表 1)。

二、胰島內(nèi)SLA-DR陽性細胞檢測

預處理各組的ICCs中SLA-DR陽性細胞數(shù)分別為2.9﹪±0.4﹪、2.3﹪±0.8﹪、2.4﹪±0.3﹪、2.0﹪±0.8﹪和12.5﹪±5.9﹪，各組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=103.154,P=0.01，表1)。

三、胰島內(nèi)淋巴樣細胞計數(shù)

預處理各組ICCs內(nèi)的淋巴樣細胞數(shù)分別為 29.0±4.1、27.0±4.0、28.0±2.8、2.6±4.0 和111.0±14.0，各組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義 (F=276.212,P=0.01,表 1)。

表1 胰島細胞免疫原性檢測結(jié)果( )

表1 胰島細胞免疫原性檢測結(jié)果( )

注：MILC為胰島-淋巴細胞混合培養(yǎng)

鰈別動物數(shù)MILC （SI）DR+ 細胞數(shù)（﹪）淋巴樣細胞數(shù)/視野A組 10 2.2±0.8 2.9±0.4 29.0± 4.1 B組 10 1.8±0.6 2.3±0.8 27.0± 4.0 C組 10 2.0±1.5 2.4±0.3 28.0± 2.8 D組 10 2.1±1.0 2.0±0.8 26.0± 4.0對照組 10 7.4±2.3 12.5±2.9 111.0±14.0 F值 30.398 103.154 276.212 P值 0.000 0.000 0.000

四、胰島素釋放試驗

經(jīng)預處理的ICCs與對照組的胰島素釋放試驗結(jié)果，高糖濃度下各組分別為（832±157），（592±126），（783±109），（872±105），（773±141）pmol/L，差異有統(tǒng)計學意義（F=6.918，P=0.000），而低糖組和釋放指數(shù)，各組差異無統(tǒng)計學意義(F=0.629，P=0.644 ；F=0.686，P=0.991，表 2)。

討 論

胰島移植的排斥反應是依賴供體的抗原呈遞細胞(antigen presenting cell，APC)或過路白細胞(passenger leukocytes)觸發(fā)的[2]。存在于APC如B淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞(dendritic cells，DC)等細胞表面的MHCⅡ類分子激活宿主CD4陽性細胞，是胰島移植后免疫排斥的主要途徑[3]。移植物的免疫原性依賴MHC抗原表達、黏附分子和所謂的過路白細胞的數(shù)量[4]。如果能夠減少或清除這些APC，可減少或防止移植物排斥。據(jù)文獻報道，大鼠的胰島細胞本身為Ia陰性，若在移植前除去移植胰島中夾雜的Ia陽性細胞，則可有效地延長移植胰島的存活時間[5]。

Lacy等[6]曾報道24℃培養(yǎng)能降低胰島的免疫原性，本研究24℃培養(yǎng)組（A組）MILC的SI較對照組（E組）明顯減少。以往對嚙齒類動物胰島的研究發(fā)現(xiàn)[7-10]，凍存后胰島的免疫原性減低，MHCⅡ類抗原或攜帶Ia抗原的陽性細胞減少，而胰島的內(nèi)分泌功能未見明顯改變。凍存組（B組）的SI明顯低于對照組。據(jù)文獻報道，中波紫外線能抑制人或動物外周血淋巴細胞增殖[11-14]。由于紫外燈都是連續(xù)波長，本研究采用了單一波長（308 nm）的準分子中波紫外激光儀定量照射。經(jīng)過24 J能量照射后的豬胰島（C組）MILC的SI明顯低于對照組差異有統(tǒng)計學意義。Steinman等[13]曾用抗MHCⅡ類單克隆抗體或DC特異性單克隆抗體預處理胰島及甲狀腺組織去除DC，同種移植后可長期存活。本研究應用抗MHCⅡ類抗原單抗對胰島細胞進行體外預處理，結(jié)果預處理組（D組）ICCs的MILC刺激指數(shù)明顯低于對照組。本組資料采用24℃培養(yǎng)、冷凍保存、紫外線照射和抗體預處理方法，均能夠降低胰島細胞對異種淋巴細胞的刺激作用，表明這些預處理方法能夠降低胰島細胞的免疫原性，與文獻報道的結(jié)果相同。

Miyamoto等[14]認為人胰島凍存后免疫原性降低可能與胰島內(nèi)APC喪失或功能減低有關，MHCⅡ類抗原陽性細胞如血管內(nèi)皮細胞、導管上皮細胞等亦明顯減少。本研究用抗MHCⅡ類抗原單抗預處理胰島細胞，選擇抗SLA-DR單抗的免疫組化來檢測胰島中MHCⅡ類抗原陽性細胞。結(jié)果顯示24℃組、凍存組、激光組和抗體組的胰島中SLA-DR陽性細胞數(shù)較對照組明顯減少，淋巴樣細胞亦明顯少于對照組。本組資料結(jié)果亦證實胰島內(nèi)抗原提呈細胞的數(shù)量與胰島的免疫原性相關。

各種預處理對胰島細胞功能的潛在不利影響一直受到關注。Faustman等[5]認為大鼠的胰島細胞是MHC-Ia陰性，除去移植胰島中夾雜的MHC-Ia陽性細胞不影響胰島細胞的活性。本組資料中，預處理各組的低糖胰島素含量、高糖胰島素含量和胰島素釋放指數(shù)與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義。提示24℃培養(yǎng)、冷凍保存、中波紫外激光照射和抗MHCⅡ類抗原單抗對胰島細胞的無明顯影響。

表2 胰島素釋放試驗結(jié)果( )

表2 胰島素釋放試驗結(jié)果( )

組別 動物數(shù) 低糖（pmol/L） 高糖（pmol/L） 胰島素釋放指數(shù)A組 10 219± 65 832±157 3.8±2.7 B組 10 171± 53 592±126 3.5±1.6 C組 10 207± 85 783±109 3.8±2.4 D組 10 213±102 872±105 4.1±3.2對照組 10 199± 57 773±141 3.9±2.9 F值 0.629 6.918 0.686 P值 0.644 0.000 0.991

本組資料結(jié)果表明，胰島細胞經(jīng)抗短期24℃培養(yǎng)、冷凍保存、中波紫外線激光照射和抗MHCⅡ類抗原單抗預處理，能明顯降低其免疫原性，同時對胰島功能無明顯影響。

1 Ricordi C,Tzakis AG,Carroll PB,et al.Human islet isolation and allotransplantation in 22 consecutive cases[J].Transplantation,1992,53:407-414.

2 Nicolls MR,Coulombe M,Gill RG.The basis of immunogenicity of endocrine allografts[J].Crit Rev Immunol,2001,21(1-3):87-101.

3 Marchetti P,Scharp DW,Finke EH,et al.Prolonged survival of discordant porcine islet xenografts[J].Transplantation,1996,61(7):1100-1102.

4 Kuttler B,Hartmann A,Wanka H.Long-term culture of islets abrogates cytokine-induced or lymphocyteinduced increase of antigen expression on beta cells[J].Transplantation,2002,74(4):440-445.

5 Faustman D,Hauptfeld V,Lacy P,et al.Prolongation of murine islet allograft survival by pretreatment of islets with antibody directed to Ia determinants[J].Proc Natl Acad Sci USA,1981,78(8):5156-5159.

6 Lacy PE,Davie JM,Finke EH.Prolongation of islet allograft survival following in vitro culture (24 degrees C) and a single injection of ALS[J].Science,1979,204(4390): 312-313.

7 Coulombe MB,Warnock GL,Rajote RV.Prolongation of islet xenograft survival by cryopreservation[J].Diabetes,1987,369: 1086-1088.

8 Flesch B,Entenmann H,Milde K,et al.Islet transplantation in experimental diabetes of the rat.XIII.Cryopreservation reduces MHC class II but not class I antigens of rat pancreatic islets[J].Horm Metab Res,1991,23(1):1-6.

9 Bretzel RG,Flesch B,Milde K,et al.The ia-antigen reducing effect of defferent cryopreservation programmes onrat pancreatic islets[J].Diabetes,1989,38(suppl.1):282-283.

10 Taylor MJ,Foreman J,Moriya H.Gryopreservation of isolated pancreatic islets under conditions thatminimize survival of passenger lymphoid cells[J].Diabetes,1989,38(suppl.1): 282.

11 Hardy MA,Lau H,Weber C,et al.Pancreatic islet trnsplantation: induction of graft acceptance by ultraviolet irradiation of donor tissue[J].Ann Surg,1984,200(4):441-450.

12 Benhamou PY,Stein E,Mullen Y.Effect of Ultraviolet-B irradiation on the function and immunogenicity of fetal porcine islet[J].Transpl proc,1994,26(2):705.

13 Benhamou PY,Mullen Y,Stein E,et al.Ultraviolet-B irradiation for immunoalteration of human islets[J].Transpl proc,1994,26(2):750.

14 Kenyon NS,Strasser S,Alejandro R.Ultraviolet light immunomodulation of canine islets for prolongation of allograft survival[J].Diabetes,1990,39(3):305-311.

13 Steinman RM,Inaba K,Austin JM.Donor-derived chimerism in recipients of organ transplants[J].Hepatology,1993,17(6):1153-1156.

14 Miyamoto M,Kenmochi T,Nakagawa Y,et al:Immuunogenicity of cryopreserved human islets[J].Transplantation proceedings,1995,27:3406-3408.