張澤生，林紀(jì)偉，2，王志平，於洪建，劉岱琳

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)醫(yī)學(xué)院生藥教研室，天津 300162；3.鄭州人民醫(yī)院藥劑科，河南 鄭州 450012；4.天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司，天津 300457）

黑豆是我國(guó)一種傳統(tǒng)種植的農(nóng)作物，其具有悠久的食用和藥用歷史，自古以來民間就有用黑大豆補(bǔ)血、活血和烏發(fā)養(yǎng)顏的記載。黑豆皮，又稱烏衣，富含大量花青素,主要以飛燕草素、矢車菊素為主[1]，具有抗氧化活性[2]、抑制誘變[3-4]、抗炎[5]、預(yù)防癌癥以及延緩衰老等多種保健功效[6]，一直是天然食用添加劑和健康保健食品的原料。

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，從南到北很多省份都種植黑豆，資源豐富，可謂世界各國(guó)之首[6]。在我國(guó)的北方，如天津市、河北省、山東省都有豐富的黑豆產(chǎn)量，但是由于產(chǎn)地不同，黑豆皮中的功效成分差異較大，因此本文在文獻(xiàn)工作基礎(chǔ)上，利用比色法測(cè)定不同產(chǎn)地黑豆皮中花青素的含量，從而進(jìn)一步控制黑豆皮的質(zhì)量，為其在食品添加劑和保健食品中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器設(shè)備

1.1.1 材料

黑豆皮原料：黃仁黑豆皮，產(chǎn)自湖北；青仁黑豆皮，產(chǎn)至東北，青扁黑豆皮，產(chǎn)自安徽；市售黑豆皮，產(chǎn)自山東濱州；內(nèi)蒙黑豆皮，產(chǎn)自內(nèi)蒙古。所有試驗(yàn)黑豆皮原料由天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司提供。

1.1.2 試劑

飛燕草素標(biāo)準(zhǔn)品：挪威Polyphenols公司；無水乙醇、甲醇：均為分析純，天津康科德化工有限公司；鹽酸：天津大茂化工有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

UV-2401PC：日本島津公司；HZQ-QX型電動(dòng)振蕩機(jī)：東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

用1%鹽酸甲醇溶液配制少量黑豆皮提取液，用UV-2401PC紫外可見分光光度計(jì)200 nm～600 nm的范圍內(nèi)對(duì)色素進(jìn)行掃描，得黑豆皮提取液的吸附光譜圖。同時(shí)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液在200 nm～600 nm的范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，得到飛燕草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸附光譜圖。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取飛燕草素對(duì)照品適量，用1%鹽酸甲醇溶液溶解，定容在100 mL容量瓶中，配制成85.211μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，備用。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

分別精密吸取 2、4、6、8、10 mL 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用1%鹽酸甲醇溶液稀釋并且定容至刻度。在520 nm下測(cè)定吸光度，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 黑豆皮提取物樣品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取黑豆皮原料5 g加入浸提液浸泡過夜，過濾，測(cè)定其體積為V。精密吸取1 mL樣品浸提液，置1000 mL棕色容量瓶中，用1%的鹽酸甲醇定容到刻度，以同批1%鹽酸甲醇溶液作空白，置520 nm處測(cè)定其吸收度?；ㄇ嗨睾坷?.2.2.2中的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 黑豆皮中花青素提取條件優(yōu)化

1.2.4.1 提取溶劑的選擇

準(zhǔn)確稱取黑豆皮5 g，共4份，分別置于100 mL三角瓶中，分別加入甲醇、95%乙醇，1%鹽酸甲醇50 mL和1%鹽酸乙醇各50 mL，浸提8 h。按照1.2.3項(xiàng)下配制方法進(jìn)行樣品制備，測(cè)量其吸光度。通過對(duì)甲醇、95%乙醇、含有體積比例為1%鹽酸的甲醇溶液和95%乙醇溶液進(jìn)行考察，確定最佳提取溶劑。

1.2.4.2 提取溶液鹽酸用量的選擇

準(zhǔn)確稱取黑豆皮5 g，共5份，分別置于100 mL三角瓶中。分別加入甲醇50 mL、0.5%鹽酸甲醇溶液（體積分?jǐn)?shù)）50 mL、1%鹽酸甲醇溶液（體積分?jǐn)?shù)）50 mL、1.5%鹽酸甲醇溶液（體積分?jǐn)?shù)）50 mL、2%鹽酸甲醇溶液（體積分?jǐn)?shù)）50 mL，浸提8 h。按照1.2.3項(xiàng)下配制方法進(jìn)行樣品制備測(cè)量其吸光度。

1.2.4.3 提取時(shí)間的選擇

準(zhǔn)確稱取黑豆皮5 g，共6份，分別置于100 mL三角瓶中，精密加入1%鹽酸甲醇50 mL。6份樣品，密封狀態(tài)下進(jìn)行提取，提取時(shí)間分別為 1、2、4、6、8、10 h。然后按照1.2.3項(xiàng)下配制方法進(jìn)行樣品制備，測(cè)量其吸光度。

1.2.4.4 料液比的選擇

準(zhǔn)確稱取黑豆皮5 g，共5份，分別置于100 mL三角瓶中。分別加入 1%鹽酸甲醇 10、25、50、75、100 mL。密閉狀態(tài)下進(jìn)行浸提8 h。然后按照1.2.3項(xiàng)下配制方法進(jìn)行樣品制備，測(cè)量其吸光度。

1.2.5 加樣回收率的測(cè)定

精密稱取已知含量的供試品原料5 g，準(zhǔn)確加入與供試品中花青素含量相同的飛燕草素對(duì)照品，按照1.2.4中確定的提取方法進(jìn)行提取，按1.2.3項(xiàng)下確定的方法準(zhǔn)確測(cè)定，計(jì)算平均回收率。

1.3 樣品的含量測(cè)定

分別準(zhǔn)確稱取不同產(chǎn)地的黑豆皮5 g，按照1.2項(xiàng)下確定的最優(yōu)提取方法進(jìn)行提取，按照1.2項(xiàng)下的含量測(cè)定方法進(jìn)行含量測(cè)定。每個(gè)產(chǎn)地的黑豆皮平行測(cè)定3次。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

圖1a是黑豆皮提取物在1%鹽酸甲醇溶液中的吸收光譜，從光譜中可以看出黑豆皮提取物分別在520、362、279、205 nm 處有吸收峰，而 520 nm 為花青素類色素的特征吸收峰。圖1b是標(biāo)準(zhǔn)品飛燕草素在1%鹽酸甲醇溶液中的吸收光譜，從光譜中可以發(fā)現(xiàn)其在520、360、280 nm處有吸收峰，綜合分析后，選擇520 nm作為黑豆皮提取物中花青素吸收度的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定及方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

按照1.2.2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。

圖1 黑豆皮提取物和標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收?qǐng)D譜Fig.1 The UV spectrum of Black Soya Bean Extract and delphinidin

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定Fig.2 Detection of linear curve

標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.0943x，（x表示為測(cè)試溶液的濃度，單位為 μg/mL），r=0.9996（n＝5），該標(biāo)準(zhǔn)曲線在濃度為1.7μg/mL～8.5μg/mL的范圍內(nèi)線性良好。

2.2.2 精密度的測(cè)定

吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，按1.2.2.2項(xiàng)下的方法進(jìn)行精密度測(cè)定，RSD=0.21%（n=6），本方法的精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性的測(cè)定

吸取供試品溶液 1 mL，分別在 2、4、6、8、10 h 后測(cè)定吸光度值。試驗(yàn)結(jié)果表明：在0～10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD=0.23%。

2.2.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取同一產(chǎn)地的黑豆皮5份，每份5 g。按1.2.4項(xiàng)下確定的方法進(jìn)行提取，再按1.2.3項(xiàng)下方法進(jìn)測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法重現(xiàn)性良好，RSD為0.74%（n=5）。

2.3 黑豆皮中花青素提取條件優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇

不同溶劑的浸提結(jié)果見表1。

表1 不同溶劑的浸提結(jié)果Table 1 Extraction using different solution

表1測(cè)試結(jié)果顯示采用1%的鹽酸甲醇溶液作為提取溶劑時(shí)，吸光度最高，說明具有很好的提取效果。因此本試驗(yàn)采用1%的鹽酸甲醇作為提取溶劑。

2.3.2 提取溶劑酸度選擇

不同鹽酸濃度的浸提結(jié)果見表2。

表2 不同鹽酸濃度的浸提結(jié)果Table 2 Extraction using different content HCl

測(cè)試結(jié)果如表2，在相同提取時(shí)間條件下，隨著鹽酸濃度的增加，測(cè)試溶液的吸光度值也在增高。說明酸度的增加會(huì)提高提取收率。但是從1%～2.5%的酸度變化，提取溶液的吸光度值增加并不明顯，因此確定提取溶液鹽酸濃度為1%。

2.3.3 提取時(shí)間的選擇

不同時(shí)間的浸提結(jié)果見表3。

表3 不同時(shí)間的浸提結(jié)果Table 3 Extraction using different time

如表3所示，浸提時(shí)間達(dá)到8 h時(shí)，吸光度值達(dá)到最高，而且隨著提取時(shí)間的增加，吸光度值達(dá)到穩(wěn)定。因而確定浸提時(shí)間為8 h。

2.3.4 料液比的選擇

不同料液比的浸提結(jié)果見表4。

表4 不同料液比的浸提結(jié)果Table 4 Extraction using different volume solution

通過對(duì)不同料液比的考察，結(jié)果如表4所示，料液比為1∶10時(shí)，吸光度值達(dá)到最高，因而確定最佳料液比為 1∶10。

2.4 加樣回收率的測(cè)定

按照1.2.5項(xiàng)下確定的方法準(zhǔn)確測(cè)定，平均回收率為 98.34%，RSD=2.32%（n=5）。

2.5 不同產(chǎn)地黑豆皮中花青素的含量

按照1.2.4項(xiàng)下確定的提取方法進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果如表5所示。分析結(jié)果如表5所示，市售的黑豆皮其花青素含量相對(duì)較低，而安徽產(chǎn)的青扁黑豆皮花青素含量相對(duì)較高。

表5 不同產(chǎn)地黑豆皮中花青素的含量測(cè)定Table 5 Detection of anthocyanidin of black soybean from different varied area

3 小結(jié)與結(jié)論

1）對(duì)國(guó)內(nèi)不同產(chǎn)地的黑豆皮原料進(jìn)行了花青素含量測(cè)定，測(cè)試結(jié)果顯示不同產(chǎn)地的黑豆皮原料中花青素的含量差異較大，品種之間以安徽產(chǎn)的青扁黑豆皮花青素含量相對(duì)較高，雖然市售黑豆皮的含量相對(duì)較低。

2）本文利用紫外分光光度法測(cè)定不同區(qū)域的黑豆皮中花青素的含量，該方法簡(jiǎn)便，快速，結(jié)果準(zhǔn)確，可靠，適于黑豆皮中花青素成分的質(zhì)量控制。

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